清氣涼營注射液中15個成分的HPLC/ESI/MS分析研究

任愛農(nóng)， 顧學(xué)紅， 王大為

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇南京 210028;2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

清氣涼營注射液是由大青葉，大黃，金銀花，知母，野菊花，淡竹葉經(jīng)提取加工制成的靜脈注射液，具有清氣泄熱、涼營化瘀等功效。臨床上治療流行性出血熱早期發(fā)熱(氣分證及氣營兩燔證)效果顯著。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，“氣”、“營”是指溫?zé)岵〉牟±戆l(fā)展階段，由于氣分及氣營兩燔階段時，病邪已到氣，并多波及營分，故應(yīng)用清氣涼營注射液治療。對于清氣涼營注射液中結(jié)合型大黃酸的HPLC研究之前已有報道［1］，而隨著液質(zhì)聯(lián)用儀的廣泛應(yīng)用，尤其是電噴霧(ESI)等軟電離技術(shù)的快速發(fā)展，HPLC/MS直接用于中藥復(fù)雜體系中化合物的定性分析已逐漸成為中藥研究的熱點技術(shù)［2-6］。本實驗對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進行分析，采用HPLC/ESI/MS方法，對清氣涼營注射液HPLC圖譜上所顯示的特征譜峰進行分析，旨在弄清清氣涼營注射液中特征譜峰的結(jié)構(gòu)及其歸屬，為進一步豐富清氣涼營注射液全方的內(nèi)涵奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和藥材

清氣涼營注射液由泰州蘇中藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)提供。大青葉來自十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥葉;金銀花來自忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花;大黃來自蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根及根莖;野菊花來自菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序;知母來自百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖;淡竹葉來自禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracile Brongn.的干燥莖葉。以上藥材均由任愛農(nóng)教授鑒定。

1.2 試劑與儀器

Waters2695型液相色譜儀(四元泵、在線脫氣及自動進樣系統(tǒng)、2996型二極管陣列檢測器);Micromass Quattro micro質(zhì)譜儀，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測器，ESI接口，Masslynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Milli-Q純水器(美國)。除甲醇為色譜純外，其余試劑均為分析純。綠原酸(S1，批號:110821-200413)和大黃酸(S2，批號:0757-200206)對照品購自于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 色譜條件

1.3.1 極性類成分色譜條件 色譜柱是Promosil C18柱(4.5 mm × 250 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫見表1;進樣量:10 μL;洗脫時間:90 min;檢測波長:325 nm;柱溫:30℃;流速:0.8 mL/min。

表1 梯度洗脫情況Tab.1 Gradient elution

1.3.2 苷元類成分色譜條件 色譜柱是Promosil C18柱(4.5 mm × 250 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫見表2;進樣量:10 μL;洗脫時間:60 min;檢測波長:440 nm;柱溫:30℃;流速:0.8 mL/min。

表2 梯度洗脫情況Tab.2 Gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化(ESI)源;離子源溫度:120℃;正負(fù)離子同時檢測;脫溶劑氣(N2)流速:500 L/h;錐孔氣(N2)流速:50 L/h;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;掃描范圍m/z:150～650;錐孔電壓:30 V;碰撞氣體為氬氣(Ar);碰撞室能量:40 V。

1.5 供試品的制備

1.5.1 極性類成分的制備 取清氣涼營注射液2 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜，備用。

1.5.2 苷元類成分的制備 取清氣涼營注射液10 mL，加過氧化氫1 mL，鹽酸2 mL，加熱回流1 h，冷卻至分液漏斗中，乙醚提取3次，每次20 mL，合并提取液，并水洗至中性，揮盡乙醚，加甲醇定容至2 mL作為供試品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.5.3 對照品的制備 取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對照品溶液。取大黃酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液作為蒽醌類成分檢測的對照品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC/UV檢測

實驗中對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進行分析，僅用單組分流動相很難達到很好的效果，因此選用以上含兩種不同組分的流動相進行分析。通過比較，酸性條件下指紋圖譜中的峰形較好，出峰時間穩(wěn)定，所以選擇甲醇－0.2%醋酸水溶液作為流動相。在極性類成分分析中，因為結(jié)果中多含有酸性成分如綠原酸及其異構(gòu)體等，所以在325 nm處出現(xiàn)的譜峰信息較多，并且峰形較好;而在苷元類成分分析中，因為多以方中大黃中含有的蒽醌類為主，所以選擇在440 nm處觀測，該波長下峰形較好，出峰時間穩(wěn)定。結(jié)果見圖1。

2.2 圖譜中各峰藥材歸屬

按照注射液制備工藝分別提取制備了只含有單味藥材的注射液，而含苷元類藥材按照注射液提取工藝提取后再進行水解并分析，以考察藥材與注射液之間的相關(guān)性，金銀花，野菊花，知母，淡竹葉按照1.3.1項下條件進樣，大黃按照1.3.2項下條件進樣，結(jié)果見圖2。由圖2A 可以看出峰1，2，3，4，6，7，9在金銀花與野菊花中均有出現(xiàn)，而峰10，11在野菊花中出現(xiàn)，其相對應(yīng)的紫外吸收也相同，峰5未在任何藥材中出現(xiàn)，可能是在注射液制備過程中產(chǎn)生的新的化合物。由圖2B可以看出12，13，14，15均在大黃藥材中出現(xiàn)，推測這4個峰是大黃蒽醌類化合物。

圖1 清氣涼營注射液HPLC/UV指紋譜圖Fig.1 The HPLC/UV fingerprint of Qingqi Liangying Injection

圖2 清氣涼營注射液與藥材指紋圖譜相關(guān)性比較Fig.2 The relativity between the fingerprints of Qingqi Liangying Injection and medical material

2.3 HPLC/MS檢測

圖3 清氣涼營注射液HPLC/MS譜圖ESI(－)Fig.3 The HPLC/MS spectra of Qingqi Liangying Injection ESI(－)

分別以正、負(fù)離子模式全面檢測清氣涼營注射液中各類化合物。經(jīng)條件優(yōu)化，最終確定了1.4和1.3項下的色譜和質(zhì)譜條件。結(jié)果顯示大部分峰的負(fù)離子吸收比正離子吸收明顯。清氣涼營注射液的HPLC/MS指紋圖譜見圖3。通過所得到的一級質(zhì)譜碎片離子數(shù)據(jù)并參考相關(guān)文獻，對注射液HPLC圖譜中的部分共有峰進行了初步定性分析。

2.3.1 極性類成分的質(zhì)譜分析 根據(jù)綠原酸對照品峰的保留時間和紫外光譜數(shù)據(jù)，推出峰2為綠原酸，而質(zhì)譜數(shù)據(jù)(在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的253峰［M-H］-離子，而在正離子模式下有277峰［M+Na］+離子)也進一步確定了峰2是綠原酸;峰1和峰3具有與綠原酸相同的響應(yīng)峰，即在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的253峰［M-H］-離子，和正離子模式下有277峰［M+Na］+離子，推測峰1和峰3為綠原酸的同分異構(gòu)體新綠原酸和隱綠原酸，根據(jù)文獻［7-8］可以推斷出峰1為新綠原酸，峰3為隱綠原酸。

峰4的［M-H］-離子的m/z為179，而其正離子吸收不明顯，但其紫外吸收與綠原酸相近，都在193，218，323 nm出有最大吸收，并且藥材歸屬到金銀花與野菊花中，因此推測為咖啡酸。

峰6，峰7和峰9負(fù)離子模式下具有相同的515峰［M-H］-離子并且在正離子模式下同樣具有540峰［M+Na］-離子，推測為異綠原酸異構(gòu)體，通過文獻［8-9］，異綠原酸B和異綠原酸A的保留時間相近，且異綠原酸B先于異綠原酸A出峰，從而可以推出峰6為異綠原酸B，峰7為異綠原酸A，而峰9為異綠原酸C。

峰8的負(fù)離子模式下有較高的447峰［M-H］-離子，且在正離子模式下有較高的449峰［M+H］+離子和287峰［M-glu+H］+離子，而金銀花及其野菊花中都含有豐富的木犀草苷［10-11］，因此我們推測峰8為木犀草苷。

峰11負(fù)離子模式下有較高的591峰［M-H］-離子，正離子模式下具有較高的593峰［M+H］+離子，因此推測為蒙花苷。

峰5和峰10在正負(fù)離子模式下均無明顯吸收。

2.3.2 苷元類成分的質(zhì)譜分析 根據(jù)大黃酸對照品峰的保留時間和紫外光譜數(shù)據(jù)，推出峰14為大黃酸，而質(zhì)譜數(shù)據(jù)(在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的283峰［M-H］-離子和 239［M-CO2-H］-離子，而在正離子模式下有285峰［M+Na］+離子)也進一步確定了峰14是大黃酸。

峰12在正負(fù)離子模式下均無明顯吸收。

峰13和峰15的負(fù)離子模式下有都較高的269峰［M-H］-離子，且在正離子模式下都有較高的271峰［M+H］+離子，猜測這兩個化合物為大黃蒽醌類中的同分異構(gòu)體蘆薈大黃素和大黃素，根據(jù)文獻［12-13］，可以看出蘆薈大黃素先于大黃素出峰，因此峰13為蘆薈大黃素，而峰15為大黃素?？偨Y(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本實驗通過HPLC/ESI/MS聯(lián)用的方法對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進行定性檢測，結(jié)果顯示該方法將檢測到的15個峰中的12個峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)初步推斷出來，極性類成分中大部分為綠原酸及其異構(gòu)體和異綠原酸及其異構(gòu)體，而苷元類成分全部是大黃蒽醌類化合物，這一結(jié)果為清氣涼營注射液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。同時由于該方法能夠同時實現(xiàn)有效組分的良好分離并提供各峰的組成和結(jié)構(gòu)信息，在中藥復(fù)雜體系研究及其質(zhì)量控制方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

表3 峰1-15的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和紫外數(shù)據(jù)Tab.3 The MS and UV date of the peaks 1-15

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