整合素拮抗劑IS201對(duì)GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

肖 寧，艾文兵，劉彥廷，馮定坤

(三峽大學(xué)，湖北宜昌443000)

腦膠質(zhì)瘤是最為常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其惡性程度高、生長快、侵襲性強(qiáng)，目前，臨床上對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療效果不理想。2009年6月～2010年6月進(jìn)行本研究，擬觀察整合素拮抗劑IS201對(duì)體外培養(yǎng)的GL15腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞。RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、MTT、DMSO、碘化吡啶(PI)、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)多克隆抗體(一抗)、生物素化山羊抗兔IgG(二抗)、SABC試劑盒、胰蛋白酶、純甲醇、5%BSA封閉液、整合素αvβ3拮抗劑IS201等。

1.2 MTT法 取對(duì)數(shù)生長期的GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入 IS201，設(shè)定濃度為 25、50 μg/ml，對(duì)照組加入1640培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3 d。以570 nm為測試波長，20min內(nèi)在全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀上讀取各孔吸光度(A)值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=［(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值］×100%。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法 取對(duì)數(shù)生長期生長良好的GL15細(xì)胞消化后，調(diào)整為1×104/ml的細(xì)胞懸液，以每孔200 μl接種到24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁，棄上清液。分別加入含0(對(duì)照組)、25 μg/ml(實(shí)驗(yàn)組 1)、50 μg/ml(實(shí)驗(yàn)組 2)整合素αvβ3拮抗劑的細(xì)胞培養(yǎng)液200 μl，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20min后蒸餾水洗滌，室溫干燥。采用免疫組化SABC法，嚴(yán)格按照試劑盒要求操作，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，在高倍視野(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，取5個(gè)視野的平均光密度值(ALD)。ALD越大表示PCNA表達(dá)水平越高。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 取生長良好的GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后棄上清液，分別加入含0、25、50 μg/ml整合素αvβ3 拮抗劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)48 h后消化貼壁細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液。使用流式細(xì)胞儀檢測各孔細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增殖抑制率結(jié)果 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率分別為0、16.10%±8.86%、25.37%±7.15%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較抑制率均明顯增加(P均＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組2較實(shí)驗(yàn)組1抑制率也增加(P＜0.05)。

2.2 PCNA表達(dá)結(jié)果 對(duì)照組PCNA表達(dá)的ALD為0.698 4±0.037 6，實(shí)驗(yàn)組 1為 0.409 1±0.033 6，實(shí)驗(yàn)組2為0.287 6±0.043 7，兩實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，兩實(shí)驗(yàn)組之間比較亦有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果 見表1。

表1 IS201對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響(%，±s)

表1 IS201對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響(%，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 G0/G1 S G2/M SubG1對(duì)照組42.30±3.84 6.16±0.41 48.60±0.67 2.95±0.95實(shí)驗(yàn)組1 39.42±0.97 4.35±0.57 46.38±1.44 9.84±2.16*實(shí)驗(yàn)組2 37.30±1.02 8.84±1.12 41.27±2.58 12.54±0.46*

3 討論

在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中整合素αvβ3參與血管生成、多種生長因子與其受體相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附等生理過程，亦與人體許多其他惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、新血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過程密切相關(guān)［1］。但有關(guān)整合素αvβ3在腦膠質(zhì)瘤惡性增殖、血管生成和侵襲性生長過程中作用的研究，仍處于探索階段。研究表明，整合素αvβ3在膠質(zhì)瘤中明顯表達(dá)，且隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的升高，其表達(dá)水平明顯升高，還與其血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)呈正相關(guān)［3］。這些事實(shí)提示，整合素αvβ3可能在腦膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，整合素αvβ3極有可能成為人腦膠質(zhì)瘤綜合治療中的一個(gè)很有前途的靶點(diǎn)。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，整合素αvβ3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移和增殖能力有明顯的促進(jìn)作用［3］;抗整合素 αvβ3 的 LM609、抗整合素αvβ3和αvβ5的EMD121974等抗體，在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好的抗膠質(zhì)瘤血管生成及抑制體外培養(yǎng)的GL15腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲等作用［4］。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，整合素αvβ3對(duì)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為有正性調(diào)節(jié)作用。

IS201是另一種新發(fā)現(xiàn)的整合素αvβ3拮抗劑，不同于現(xiàn)有的整合素αvβ3拮抗劑，它有一個(gè)模擬RDG結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，故是一種高選擇性的整合素αvβ3拮抗劑［5］。目前對(duì) IS201的研究尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道并不多。動(dòng)物研究表明，IS201能夠降低大鼠C6腦膠質(zhì)瘤的血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)C6膠質(zhì)瘤的生長有明顯抑制作用［6］。本課題通過實(shí)驗(yàn)觀察IS201對(duì)體外培養(yǎng)的GL15人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，證實(shí)IS201對(duì)人腦膠質(zhì)瘤確有抑制作用，為下一步將其應(yīng)用于臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

［1］蔡強(qiáng)，葉應(yīng)湖，王國安，等.血管內(nèi)皮生長因子在人腦膠質(zhì)瘤侵襲中的作用［J］.腫瘤防治研究，2002，29(6):447-449.

［2］艾文兵，陶勝忠，薛德麟.人腦膠質(zhì)瘤中VEGF和整合素αvβ3的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.腫瘤防治研究，2005，32(2):70-72.

［3］D'Abaco GM，Ng K，Paradiso L，et al.ADAM22，expressed in normal brain but not in high-grade gliomas，inhibits cellular proliferation via the disintegrin domain［J］.Neurosurgery，2006，58(1):179-186.

［4］馮定坤，艾文兵，劉彥廷，等.整合素αvβ3抗體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲力的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(2):4-5.

［5］孫沛，許云祿.整合素及其拮抗劑研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)專論，2007，16(1):1-3.

［6］艾文兵，馮定坤，熊志云，等.整合素αvβ3拮抗劑治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(6):32-33.