3'單肟靛玉紅的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

許利剛，張書剛，張仕林，張穎冬

上世紀(jì)70年代，中國(guó)醫(yī)學(xué)家們?cè)趥鹘y(tǒng)中成藥當(dāng)歸蘆薈丸中發(fā)現(xiàn)，青黛的抗腫瘤有效成分是靛玉紅(Indirubin)，其對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的治療已經(jīng)用于臨床［1-2］。靛玉紅的衍生物對(duì)其他腫瘤的抑制作用也正在研究中［3-5］。目前已經(jīng)清楚，靛玉紅是一種選擇性的Cdks抑制劑，是Cdk1、Cdk2和Cdk5的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［6］，它可以在納摩爾水平抑制Cdk1、Cdk2和Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的毒性。3'單肟靛玉紅(Indirubin-3'-monoxime，IMX)是其衍生物之一。IMX不僅具有Cdks抑制劑的基本特點(diǎn)，而且有較好的膜通透性，可以與ATP競(jìng)爭(zhēng)Cdks激酶的催化位點(diǎn)［7］。體外試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，其可以抑制引起tau蛋白過度磷酸化的GSK-3β和Cdk5/p25激酶活性。此外，在體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元上，IMX還可以通過劑量依賴性地抑制c-JunN末端蛋白激酶(JNK)減少細(xì)胞應(yīng)激所致的凋亡［8］。此外，IMX可以抑制β淀粉樣蛋白對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性［9］。在最近的 AD 小鼠動(dòng)物模型中［10］也證實(shí)，IMX可以改善小鼠的記憶能力并且減輕β淀粉樣蛋白引起的病理學(xué)變化。IMX極有希望成為阻止AD進(jìn)展的重要靶標(biāo)。

鑒于Cdks抑制劑的研究已經(jīng)從單純的抗腫瘤作用擴(kuò)展到神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)疾病的治療，因此，對(duì)小分子Cdks抑制劑IMX相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)研究很有必要。本文應(yīng)用高效液相色譜法，通過測(cè)定不同給藥途徑鼠血漿中IMX濃度，得出IMX的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，研究了IMX在鼠體內(nèi)主要器官的分布，為進(jìn)一步研究IMX在人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程及藥物的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前均在衛(wèi)生的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。室溫(20±2)℃。

1.2 主要儀器設(shè)備 CS-15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman公司;Waters高效液相色譜:美國(guó)Waters公司;Waters 2487紫外檢測(cè)器:美國(guó)Waters公司;Breeze型色譜工作站:美國(guó)Waters公司;Waters1525 Binary HPLC Pump:美國(guó)Waters公司;754P分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;DY89-1電動(dòng)勻漿機(jī):寧波新芝科學(xué)儀器研究所。

1.3 藥品和試劑 IMX標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司購(gòu)入，實(shí)驗(yàn)前用DSMO溶解稀釋至所需濃度。

1.4 HPLC測(cè)定IMX的濃度

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)條件 色譜柱為Hanbon-C18(5 μm，4.6 mm ×200 mm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(70∶30)，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4.2 大鼠血漿樣品的預(yù)處理［11］將每次收集的血樣0.2 mL置于1.5 mL的離心管中(內(nèi)含1%的肝素 0.5 μL，80 ℃ 烘干)，2 500轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液0.1 mL，加入0.2 mL乙腈，9 000轉(zhuǎn)離心10 min，上清液20 μL測(cè)IMX的濃度。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱IMX 10 mg，氯仿∶甲醇(1∶1)溶解，配制成濃度為1 mg/mL的貯備液(Ⅰ)。實(shí)驗(yàn)前取貯備液(Ⅰ)1 mL用氯仿∶甲醇(1∶1)稀釋成濃度為10 μg/mL的貯備液(Ⅱ)。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別取大鼠新鮮血漿1 mL，依次加入貯備液(Ⅱ)，配成濃度為 0.1、0.3、0.6、1.0、2.0、3.0和4.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按血樣處理的方法進(jìn)行處理。按HPLC測(cè)定條件，分別測(cè)定IMX峰面積，繪制面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=a+b C。

1.4.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 分別取0.2 mL大鼠新鮮血漿，加入 IMX溶液，使其濃度分別為0.6、2.0、4.0 μg/mL，按與血樣處理同法處理，HPLC測(cè)定回收率和日內(nèi)、日間精密度。

1.4.5 大鼠血漿中IMX濃度的測(cè)定 分別取靜脈注射、腹腔注射后的血樣，按血樣處理方法處理，取20 μL用HPLC法分別測(cè)其峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濃度，繪制濃度-時(shí)間曲線。

1.5 IMX藥代動(dòng)力學(xué)研究

1.5.1 靜脈給藥與采血方法 雄性SD大鼠10只，實(shí)驗(yàn)前用乙醚麻醉，尾靜脈注射IMX 10 mg/kg(以DSMO為溶劑)，于注射IMX前及注射后2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、180 和 240 min，分別由眼球后取血0.2 mL，置于肝素管中。

1.5.2 組織分布實(shí)驗(yàn) 大鼠42只隨機(jī)分成7組，每組6只，一組處死取心、肺、腎、腦組織各2 g，按1∶1 加入生理鹽水，15 000 r/min 勻漿 1 min，高速離心(10 000 g)5 min，取上清液0.2 mL，加入乙腈0.4 mL，10 000轉(zhuǎn)離心10 min，上清液分別過膜，用HPLC法測(cè)定IMX濃度作為對(duì)照組。其他6組尾靜脈注射 IMX 溶液 10 mg/kg，于 0.5、1、2、3、4和5 h分別處死，取心、肺、腎、腦組織各2 g，按上述方法同樣處理，用HPLC法分別測(cè)定各組織中IMX的峰面積，應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線查得濃度，繪制濃度-時(shí)間曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理 血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分別按照一室、二室、三室模型，運(yùn)用Marquardt法迭代擬合，通過對(duì)模型擬合的評(píng)價(jià)，利用F檢驗(yàn)法及根據(jù)AIC最小的原則選出最佳模型，采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)編3P87程序，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度測(cè)定方法的確證

2.1.1 IMX的光譜特征 紫外光譜掃描結(jié)果顯示，IMX在365 nm處有一個(gè)吸收峰，所以選定365 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。按 HPLC法測(cè)定表明，IMX的保留時(shí)間為4.437 min(見圖1)。

圖1 大鼠血漿IMX色譜圖注:A.空白血漿，B.空白內(nèi)標(biāo)，C.IMX 10 mg/kg iv 10 min;1.IMX，2.solvent

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 HPLC測(cè)定IMX的線性范圍為0.14～4.0 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A=75.440 5 C-1.166 4，r=0.999 16。

2.1.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 將回收率實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出IMX濃度，以測(cè)定值與實(shí)際值之比計(jì)算回收率。0.6、2.0和4.0 μg/mL 3種濃度的日內(nèi)平均相對(duì)回收率為99.05%、98.85%和97.12%。日內(nèi)精密度RSD＜3%(n=5)，日間精密度RSD＜4%(n=5)，符合目前生物分析方法指導(dǎo)原則的要求。

2.2 IMX的藥時(shí)曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 大鼠尾靜脈注射IMX后，各時(shí)間點(diǎn)IMX的血藥濃度均在檢測(cè)范圍內(nèi)，IMX的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。用3P87藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)IMX在大鼠體內(nèi)的血藥濃度分別按照一室、二室、三室模型運(yùn)用Marquardt法迭代擬合，對(duì)擬合結(jié)果進(jìn)行比較，其中二室模型為最優(yōu)模型。IMX的藥代動(dòng)力學(xué)方程為C=1.37e-0.0731t+0.29e-0.0048t，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

圖2 IMX平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表1 靜脈給與IMX 10 mg/kg的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 組織分布研究 大鼠尾靜脈注射IMX后，IMX在各組織中的平均濃度-時(shí)間曲線見圖3。IMX在肺組織中的分布0.5 h達(dá)高峰，而后降低;IMX在腦中的分布0.5 h達(dá)高峰，而后逐漸降低;IMX在心臟組織中的含量較高，1 h達(dá)到高峰，而后逐漸降低;IMX在腎臟組織中的分布顯示，在3 h達(dá)高峰，而后迅速降低。

圖3 3'單肟靛玉紅10 mg/kg靜脈給藥后的組織分布

3 討論

本研究方法采用甲醇∶水(70∶30)作為流動(dòng)相，用HPLC-UV法測(cè)定大鼠血漿中IMX的濃度，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾IMX的測(cè)定，IMX的保留時(shí)間為4.437 min，操作省時(shí)、簡(jiǎn)便、精密度及重現(xiàn)性均較好。

尾靜脈注射IMX后，大鼠尾靜脈注射IMX后的藥代動(dòng)力學(xué)過程用開放的二室模型來描述較為合理。T1/2α為 9.70 min，α 為 0.073/min，β 為0.004 8/min，T1/2β為 129.26 min，遠(yuǎn)大于 T1/2α，說明IMX在體內(nèi)以消除過程為主。K12大于K21，說明IMX從中央房室向外周房室轉(zhuǎn)運(yùn)速率大于從外周房室向中央房室的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。穩(wěn)態(tài)表觀分布容積 Vss［=VC(1+K12/K21)］為 35.807 L/kg，中央室表觀分布容積VC為9.605 L/kg，中央室表觀分布容積占總表觀分布容積的29.27%，說明藥物主要分布在體循環(huán)和血流豐富的組織中。一方面可能由于IMX屬脂溶性物質(zhì)，易溶于有機(jī)組織;另一方面，可能是IMX在大鼠體內(nèi)經(jīng)過肝臟的首關(guān)消除轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，因而在血漿中測(cè)定的濃度較低，其原因有待進(jìn)一步研究。

藥物進(jìn)入血液從血流向中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布，主要在藥物進(jìn)入細(xì)胞間隙和腦脊液時(shí)受到限制。腦組織的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密相連，不具有多數(shù)組織毛細(xì)血管內(nèi)皮組織之間的小孔和吞飲小泡，而且外表面幾乎全為星形膠質(zhì)細(xì)胞包圍。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得某些大分子、脂溶性差或解離度大的藥物難于進(jìn)入腦組織。藥物能否進(jìn)入腦組織，取決于藥物的脂溶性和解離度［12］。根據(jù)IMX的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其脂溶性高，解離度小，較易進(jìn)入腦組織。大鼠尾靜脈注射IMX后，IMX在腦中的分布0.5 h達(dá)高峰，而后逐漸降低，說明IMX進(jìn)入腦組織時(shí)，易于透過血腦屏障，可能以被動(dòng)擴(kuò)散為主，需要進(jìn)一步研究加以證實(shí)。大鼠靜脈注射IMX后，IMX在大鼠的肺、心臟、腎臟組織中的分布結(jié)果顯示，IMX在肺組織中的分布0.5 h達(dá)高峰，而后降低;IMX在心臟組織中的含量較高，1 h達(dá)到高峰，而后逐漸降低;IMX在腎臟組織中的分布顯示，在3 h達(dá)高峰，而后迅速降低。通過研究IMX在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程及其在大鼠體內(nèi)的分布，為IMX的臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)，但在不同種屬動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝過程以及病理情況下的藥物代謝過程還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Hoessel R，Leclerc S，Endicott JA，et al.Indirubin，the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine，inhibits cyclin-dependent protein kinases［J］.Nat Cell Biol，1999，1(1):60-67.

［2］ 劉佳，曾琛，胡蘭萍，等.靛玉紅對(duì)慢性髓性白血病K562細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，15(2):10-12.

［3］ 陳小兵，羅素霞，張軍輝，等.靛玉紅甲肟對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC-1和Kyse70體外增殖和細(xì)胞周期的影響［J］.腫瘤，2009，29(4):350-353.

［4］ 吳琦瑋，葛忠良，高月，等.靛玉紅對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究及相關(guān)機(jī)制探討［J］.天津中醫(yī)藥，2008，255(1):55-58.

［5］ 陳小兵，張軍輝，董文杰，等.靛玉紅甲肟對(duì)HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制［J］.中國(guó)癌癥雜志，2009，19(7):503-506.

［6］ Choi SJ，Lee JE，Jeong SY，et al.5，5'-substituted indirubin-3'-oxime derivatives as potent cyclin-dependent kinase inhibitors with anticancer activity［J］.J Med Chem，2010，53(9):3696-3706.

［7］ Leclerc S，Garnier M，Hoessel R，et al.Indirubins inhibit glycogen synthase kinase-3 beta and Cdk5/p25，two protein kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer's disease.A property common to most cyclin-dependent kinase inhibitors［J］.J Biol Chem，2001，276(1):251-260.

［8］ Yuanbin X，Liu Y，Ma C，et al.Indirubin-3-oxime inhibits c-Jun NH2-terminal kinase:anti-apoptotic effect in cerebellar granule neurons［J］.Neurosci Lett，2004，367(3):355-359.

［9］ Zhang S，Zhang Y，Xu L，et al.Indirubin-3'-monoxime inhibits beta-amyloid-induced neurotoxicity in neuroblastoma SHSY5Y cells［J］.Neurosci Lett，2009，450(2):142-146.

［10］ Ding Y，Qiao A，F(xiàn)an GH.Indirubin-3'-monoxime rescues spatial memory deficits and attenuates beta-amyloid-associated neuropathology in a mouse model of Alzheimer's disease［J］.Neurobiol Dis，2010，39(2):156-168.

［11］ Deng XY，Zheng SN，Gao GH，et al.Determination and pharmacokinetic study of indirubin in rat plasma by high-performance liquid chromatography［J］.Phytomedicine，2008，15(4):277-283.

［12］ 殷志爽，王維聰，游遠(yuǎn)，等.HPLC測(cè)定大鼠血清中靛玉紅的含量及其藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(9):1148.