張長瑩,張莉莉,李玉峰,李文良,劉 捷,陳 聞,姜 平
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)
豬嗜血支原體(CandidatausMycoplasma haemosuis)是一種寄生于豬紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)的寄生生物,可引起以溶血性貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床癥狀的傳染病[1],臨床上患病豬因呈慢性感染而增加對其它呼吸道和消化道病原的易感性。
近年來,M.haemosuis病的流行呈增長趨勢,而該病的常規(guī)檢測方法主要為光鏡檢查和血清學(xué)方法。其中血清學(xué)方法包括補體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等[2-3],但由于M.haemosuis尚無成熟的體外培養(yǎng)方法,難以獲得大量原始抗原而限制了血清學(xué)方法的應(yīng)用。與鏡檢和血清學(xué)方法相比,PCR檢測方法具有靈敏度高及特異性強的優(yōu)點。Gwaltney等根據(jù) M.haemosuis基因文庫KSU-2克隆的序列資料,設(shè)計并合成引物,首次建立了M.haemosuis的PCR診斷方法[4];Messick等根據(jù)M.haemosuis16S rRNA基因序列(U88565)設(shè)計3套引物進行PCR擴增,其中兩套引物無非特異擴增[5];Hoelzle等將純化的M.haemosuis基因組用EcoRⅠ酶切后獲得一段1.8 kb DNA片段,根據(jù)該片段設(shè)計引物建立了PCR方法[6];Hoelzle等利用MSG1基因建立了熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測方法,可區(qū)別臨床M.haemosuis病豬和健康豬[7]。目前國內(nèi)也已經(jīng)有PCR診斷方法的報道[8-10],表明PCR檢測方法的靈敏性高,是有效的病原確診方法。
本研究以M.haemosuis的16S rRNA序列為靶序列,建立PCR和FQ-PCR診斷方法,選擇效果較好的檢測方法,為建立該病動物模型提供有效的檢測手段。
1.1 病料、菌株和病毒株 血液樣品采集自浙江蕭山錢江某疑似發(fā)病豬場,挑取血液涂片鏡檢為陽性的血液樣品備用;E.coliDH5α菌株、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、腸致病性大腸桿菌(ETEC)、豬鏈球菌(S.suis)、多殺性巴氏桿菌(P.multocida)、豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)為本實驗室保存;M.haemosuis由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所惠贈。
1.2 主要實驗試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、Premix ExTaqTM、pMD18-T 載體、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ均購自TaKaRa公司;溶菌酶和蛋白酶K均購自Sigma公司;凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomiga公司。
1.3 引物及探針 根據(jù)GenBank登錄的M.haemosuis 16S rRNA基因序列 (FJ263944)設(shè)計引物和探針(表1)。16S rRNA全基因擴增引物為P1和P2,預(yù)期擴增片段大小為1473 bp;常規(guī)PCR檢測引物為P3和P4,預(yù)期擴增片段大小為400 bp;FQ-PCR檢測引物為P5和P6。引物和探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
表1 引物序列Table 1 Primers sequence
1.4 M.suis16S rRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將臨床采取的疑似陽性豬血樣品,參照文獻[6]方法提取基因組DNA,并以其為模板使用P1和P2擴增M.haemosuis16S rRNA基因,同時以相同方法提取的健康豬血DNA作為陰性對照。反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃ 1 min、51℃ 45 s、72℃ 90 s,35個循環(huán);72℃ 10 min?;厥誔CR產(chǎn)物并克隆入pMD18-T載體中,對重組質(zhì)粒進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定和測序分析。測序結(jié)果經(jīng)序列相似性分析,確定為M.haemosuis16S rRNA基因(HQ259257)。
1.5 常規(guī)PCR檢測方法的建立
1.5.1 常規(guī)PCR擴增及條件優(yōu)化 以構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒為模板,P3和P4為引物進行PCR擴增,反應(yīng)程序為:94℃5 min;94℃ 1 min、51℃30 s、72℃ 30 s,34個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。分別改變鎂離子、dNTP以及引物濃度進行優(yōu)化,選擇PCR反應(yīng)的最佳體系。
1.5.2 常規(guī)PCR的敏感性和特異性試驗 將標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒進行10倍系列稀釋,以不同稀釋度(1.0×108copies/2 μL~1.0×102copies/2 μL)的重組質(zhì)粒為模板,按照最佳條件進行PCR擴增,檢測其敏感性。
特異性試驗為以M.haemosuisDNA為試驗樣品,S.chderaesuis、ETEC、S.suis、P.multocida、豬肺炎支原體、H.parasuis和PCV2基因組DNA為對照樣品,按照最佳條件進行PCR擴增。
1.6 FQ-PCR檢測方法的建立
1.6.1 FQ-PCR擴增及條件優(yōu)化 應(yīng)用兩步法PCR擴增:95℃ 2 min;95℃ 15 s、60℃退火/延伸1 min,40個循環(huán)。矩陣法對FQ-PCR的引物濃度和探針濃度進行優(yōu)化,以得到最佳的熒光量PCR反應(yīng)條件。
1.6.2 FQ-PCR的敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以M.haemosuis16S rRNA標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,10倍系列稀釋至 1.0×107copies/2 μL~1.0×100copies/2 μL為模板,最佳條件下進行FQ-PCR擴增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析Ct值,確定檢測范圍。
1.6.3 FQ-PCR的特異性試驗 以M.haemosuis DNA為模板在最佳條件下進行實時FQ-PCR分析,同時對上述7種對照病原體DNA樣品進行檢測,以驗證該方法的特異性。
1.6.4 FQ-PCR對模板的定量 以1.0×105copies/2 μL、1.0×104copies/2 μL 和 1.0×103copies/2 μL的標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒為模板在最佳條件下進行FQ-PCR分析,每個樣品做3個重復(fù),根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算模板DNA含量,并將該理論值與已知濃度進行比較,同時驗證該方法的重復(fù)性。
1.7 臨床樣品檢測 從江蘇、浙江、四川和廣東等地不同豬場無菌采取抗凝血,選擇經(jīng)鮮血壓片檢查疑似為M.haemosuis感染的20份豬血樣品,分別提取DNA,應(yīng)用建立的常規(guī)PCR和FQ-PCR兩種方法進行檢測,并設(shè)立陰、陽性對照。比較兩種檢測方法的特異性和敏感性。
2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以疑似陽性M.suisDNA為模板,用引物P1、P2擴增16S rRNA基因,電泳結(jié)果顯示,擴增出的條帶大小與預(yù)期目的片段(1473 bp)相符(圖1A)。將回收產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體后進行酶切鑒定,結(jié)果顯示酶切條帶與目的片段大小相符(圖1B)。提取重組質(zhì)粒后進行定量,濃度為67.7 ng/μL。根據(jù)插入片段大小將其換算成拷貝數(shù)為1.51×1010copies/μL,將該重組質(zhì)粒1.5倍稀釋為1.0×1010copies/μL,取2μL作為模板進行PCR檢測。
2.2 PCR體系的優(yōu)化 通過條件優(yōu)化得到最佳的常規(guī)PCR反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、25 mmol/L MgCl21.0 μL、20 mmol/L引物 P3 和 P4 各 0.25 μL、模板 2.0 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL。最佳的FQ-PCR反應(yīng)體系為:10×ExTaqBuffer 10 μL、Rox Reference Dye(50×)0.4 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL、探針(10 μmol/L)0.8 μL、模板 2.0 μL。
2.3 常規(guī)PCR的敏感性和特異性 以系列稀釋的重組質(zhì)粒為模板進行的PCR檢測,當(dāng)DNA拷貝數(shù)為1000時,未觀察到特異性條帶,表明該PCR的敏感度為104個核酸分子(圖2);特異性試驗的電泳結(jié)果顯示僅M.haemosuisDNA可以擴增出大小約400 bp的特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果符合,其它均呈陰性(圖3),表明該方法具有良好的特異性。
圖1 豬嗜血支原體16S rRNA基因的擴增(A)和重組質(zhì)粒的酶切鑒定(B)Fig.1 Amplification of M.haemosuis16S rRNA(A)and identification(B)of recombinant plasmid with restriction enzyme digestion
圖2 常規(guī)PCR敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test of conventional by PCR
圖3 常規(guī)PCR特異性試驗Fig.3 Specificity test of conventional by PCR
2.4 FQ-PCR的敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒DNA為模板進行FQ-PCR擴增,繪制曲線,結(jié)果顯示,該方法能夠檢測核酸分子 DNA的下限為10個拷貝(圖 4)。以Ct值為 Y軸,重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其斜率為-3.386,軸截距為38.102,方程為y=-3.386x+38.102。標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很高的相關(guān)性,R2>0.99(圖 5)。
圖4 FQ-PCR敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of FQ-PCR
圖5 FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of FQ-PCR
2.5 FQ-PCR的特異性 FQ-PCR特異性試驗中只有M.suisDNA樣品產(chǎn)生特異性熒光曲線,對照組為陰性(圖6),表明FQ-PCR方法具有良好的特異性。
圖6 FQ-PCR特異性試驗Fig.6 Specificity test of FQ-PCR
2.6 FQ-PCR對模板的定量 將起始濃度為1.0×105copies/2 μL、1.0×104copies/2 μL 和 1.0×103copies/2 μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行定量,顯示其實際檢測濃度分別為 1.009×105copies/2 μL、0.996×104copies/2 μL 和 1.032×103copies/2 μL,表明該方法能夠較為準(zhǔn)確的對模板DNA進行定量,并且具有較好的重復(fù)性。
2.7 臨床樣品檢測 臨床上選擇20份血液涂片判定為M.haemosuis感染陽性的抗凝血進行DNA提取,應(yīng)用本研究中建立的兩種PCR方法分別進行檢測,結(jié)果顯示常規(guī)PCR檢測方法的陽性率為60%(12/20),F(xiàn)Q-PCR檢測方法的陽性率為75%(15/20)(表 2)。
表2 臨床樣品檢測結(jié)果Table 2 Results of clinical samples detection
嗜血支原體16S rRNA基因相對比較保守,是目前研究較多的基因序列。在不同分離株中該基因的5'端和3'端幾乎100%同源,但是在基因的中間部位變異較大,可用于不同屬的鑒別。本研究根據(jù)M.haemosuis16S rRNA的基因序列特點設(shè)計引物,擴增其16S rRNA全基因片段,建立PCR和FQ-PCR兩種檢測方法并進行比較。本研究建立的PCR方法對M.heamosuis最低檢出量為104個拷貝DNA(45 pg),比王妍等和張浩吉等建立的PCR方法對M.haemosuis的敏感性好[8-9];FQ-PCR方法最低檢測10個拷貝,敏感性是普通PCR方法的1000倍,與臨床樣品檢測結(jié)果相符。此外,臨床FQ-PCR檢測可根據(jù)Ct值和模板拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系計算樣品模板的DNA含量。
目前,常規(guī)的M.haemosuis病原學(xué)診斷方法主要為血液涂片鏡檢和PCR。血液涂片鏡檢是最快速的診斷方法,但存在較高的假陽性率;常規(guī)PCR方法的特異性和敏感性均較高。本研究建立的常規(guī)PCR方法具有較高的敏感性和良好的特異性,與鏡檢方法結(jié)合可以滿足對普通臨床樣品檢測的要求。與常規(guī)PCR檢測方法相比,F(xiàn)Q-PCR方法對試驗操作和儀器設(shè)備的要求較高,但該方法具有更高的敏感性,并且能夠?qū)悠分心康幕虻暮窟M行精確定量,因而更適用于M.haemosuis臨床發(fā)病的早期表明和急性期檢測。
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