牛分枝桿菌三重PCR檢測(cè)方法的建立

錢愛(ài)東，王 建，王春芳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種人獸共患傳染病[1]。目前，牛結(jié)核病的防治主要采用牛結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢疫，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離或捕殺。然而，當(dāng)感染副結(jié)核分枝桿菌等環(huán)境中的分枝桿菌時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，并且不能辨別患病牛和BCG免疫牛[2-3]。應(yīng)用該防治措施不能有效地控制牛結(jié)核病，反而使該病近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[4]。

研究證實(shí)，在M.bovisrecA基因中存在內(nèi)蛋白插入位點(diǎn)。在recA-a位點(diǎn)存在一個(gè)1320 bp的內(nèi)蛋白編碼基因，該內(nèi)蛋白只存在于M.bovis和結(jié)核分枝桿菌中，在其他分枝桿菌中均不存在，應(yīng)用該內(nèi)蛋白診斷結(jié)核病不受其他分枝桿菌的干擾[5-8]。IS6110是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)中共有的插入序列，其大小為1361 bp，為功能性轉(zhuǎn)座子[9]。IS1081在MTBC中有6個(gè)拷貝[10]。因此，本研究以M.bovis recA、IS6110和IS1081為對(duì)象建立三重PCR反應(yīng)，為研究新型診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株M.bovisValleeⅢ株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；人結(jié)核臨床分離株為長(zhǎng)春市結(jié)核病醫(yī)院惠贈(zèng)；副結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、豬大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛葡萄球菌和豬鏈球菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000和dNTPs均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司。

1.3 染色體DNA的提取 將M.bovisValleeⅢ接種于改良的羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7周后按文獻(xiàn)[11]方法提取染色體DNA。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的recA(BX248343)、IS6110(X57835)和 IS1081(X61270)基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)擴(kuò)增引物，序列為：recA-P1(1965-1982)：5'-CGGATCACGGAATAGCGG-3'；recAP2(1117-1134)： 5'-GATGGCAGGGATGGTTGG-3'；IS6110-P1(3126-3143)：5'-TACGGTGCCCGCAAAGT G-3'； IS6110-P2(3633-3652)： 5'-TTGATCGTCTCGG CTAGTGC-3'； IS1081-P1(1268-1287)： 5'-ATCGGGT ACTCGACGCTCTG-3'；IS1081-P2(1597-1615)： 5'-G GGTGTTGGTGGTTTGCTG-3'；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 recA、IS6110和 IS1081基因的 PCR擴(kuò)增以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，分別擴(kuò)增recA、IS6110和IS1081基因。反應(yīng)條件為：98℃8 min，96℃ 1 min、54℃ (53.5℃、54℃)1 min、72℃1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 recA、IS6110和IS1081基因PCR產(chǎn)物的純化及序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用BLAST進(jìn)行序列分析。

1.7 recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)的建立以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，在同一PCR反應(yīng)中加入引物recA-P1和recA-P2、IS6110-P1和IS6110-P2以及IS1081-P1和IS1081-P2，建立recAIS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(總體積為 25 μL)為：10×Buffer 2.5 μL，recA-P1、recAP2、IS6110-P1、IS6110-P2、IS1081-P1、IS1081-P2(25 pmol/μL)各 0.3 μL，dNTPs(10 mmol/μL)3 μL，TaqDNA 聚合酶 1.5 μL(5 u/μL)。PCR 反應(yīng)條件為：98℃8 min；96℃1 min、53.5℃ 1 min、72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn) 測(cè)定模板DNA濃度，將所提取的DNA依次做10倍梯度稀釋，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。均進(jìn)行5次以上的擴(kuò)增反應(yīng)。用副結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、人結(jié)核臨床分離株、豬大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛葡萄球菌和豬鏈球菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每次擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和以M.bovisDNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 recA、IS6110和IS1081基因的PCR擴(kuò)增及序列分析 以M.bovis染色體DNA為模板，分別對(duì)recA、IS6110和IS1081基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)大小約860 bp、520 bp和340 bp的DNA片段。測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增的recA、IS6110和IS1081基因大小分別為866bp、527 bp和348 bp。BLAST分析結(jié)果顯示所獲得的recA、IS6110和IS1081基因與 GenBank中登錄M.bovisAF2122/97recA、IS6110和IS1081基因的同源性均達(dá)到99%。

2.2 recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)的建立以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，在同一PCR反應(yīng)中同時(shí)加入3個(gè)基因的引物進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)3個(gè)DNA片段，與預(yù)期的DNA片段大小相符(圖 1)。

2.3 PCR擴(kuò)增的敏感性和特異性 通過(guò)DNA分光光度法測(cè)定模板DNA濃度為390 μg/mL，將基因組DNA梯度稀釋，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，recA、IS6110和IS1081基因PCR擴(kuò)增的敏感性分別達(dá)到585 fg、19.5 fg和19.5 fg(圖2～圖4)。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該P(yáng)CR反應(yīng)只能擴(kuò)增出M.bovis和人結(jié)核臨床分離株，其他擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果均為陰性(圖5)。

圖1 recA-IS6110-IS1081基因三重PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of recA,IS6110 and IS1081 by triple PCR

圖2 recA基因敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of recAgene by PCR detection

圖3 IS6110基因敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of IS6110 gene by PCR detection

圖4 IS1081基因敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of IS1081 gene by PCR detection

本研究以M.bovis染色體DNA為模板，以3個(gè)特異性引物擴(kuò)增recA、IS6110和IS1081基因，并建立了M.bovis三重PCR檢測(cè)方法。為進(jìn)一步研究M.bovis recA、IS6110和IS1081基因作為新型診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

2008年，謝芝勛等建立了鑒別M.bovis和結(jié)核分枝桿菌的雙重PCR快速檢測(cè)方法，檢測(cè)的敏感性達(dá)到50 pg[12]。2010年，謝志勤等根據(jù)結(jié)核分枝桿菌23SrRNA基因序列和M.bovis特殊基因序列建立了結(jié)核分枝桿菌和M.bovis雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，結(jié)果可檢測(cè)到10 copies模板的M.bovis和結(jié)核分枝桿菌[13]。本研究所建立的recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)，經(jīng)敏感性和特異性試驗(yàn)驗(yàn)證，可做為M.bovis和結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查工具。

圖5 特異性試驗(yàn)Fig.5 Specificity tests of recA,IS6110,and IS1081 gene by PCR detection

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