白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究*

于曉紅，宋 娜，胡艷文

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，哈爾濱 150040；2.天津市塘沽區(qū)婦幼保健院，天津 319000)

白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究*

于曉紅1，宋 娜1，胡艷文2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，哈爾濱 150040；2.天津市塘沽區(qū)婦幼保健院，天津 319000)

[目的]研究白附子混懸液對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，探討其抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制。[方法]采用H22荷瘤小鼠模型為研究對(duì)象，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)小鼠血清中白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）水平；用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）法分析對(duì)CD4+，CD8+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。[結(jié)果]白附子混懸液能夠上調(diào)荷瘤小鼠血清IL-2細(xì)胞因子的表達(dá)，降低IL-4水平，可以使CD4+T細(xì)胞表達(dá)升高，CD8+T細(xì)胞表達(dá)降低。[結(jié)論]白附子混懸液能夠通過調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體異常免疫功能狀態(tài)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

白附子混懸液；H22細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

白附子，為天南星科多年生草本植物獨(dú)角蓮（Typhonium giganteum Engl）的塊莖。產(chǎn)于河南、甘肅、湖北、黑龍江等地。味微辛，性溫，有毒，歸胃，肝經(jīng)。具有祛風(fēng)痰、燥濕、定驚、散結(jié)止痛之功效，外用治瘰疬痰核[1]。白附子的化學(xué)成分及藥理作用近年來已有報(bào)道，主要含有脂肪酸、甾體類化合物、揮發(fā)油成分、氨基酸和微量元素等。白附子的藥理學(xué)作用主要有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、止痛，并對(duì)多種惡性腫瘤具有一定的抑瘤效果[2－5]。白附子治療各種腫瘤在民間廣為應(yīng)用，但目前尚無對(duì)其抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究報(bào)道[6]。前期研究表明白附子混懸液（SGTR）通過體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤，抑瘤率可達(dá)

39.14%。在前期研究的基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步對(duì)白附子混懸液抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行深入研究分析，為研制一新型抗腫瘤輔助藥物提供現(xiàn)代免疫學(xué)資料。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 動(dòng)物 選用健康昆明種小鼠（KM），（20±2.0）g（6～8周齡），雌雄各半，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。許可證號(hào)：黑醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單項(xiàng)準(zhǔn)第61號(hào)。

1.2 H22瘤株 由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.3 藥物及試劑

1.3.1 藥物 1）白附子鮮品購于黑龍江省五常市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)室專家鑒定為天南星科植物獨(dú)角蓮的塊莖。去須、洗凈、切成約2mm的厚片，經(jīng)60℃烘干粉碎，過80目篩，臨用時(shí)以雙蒸餾水溶解成不同濃度（按倍比稀釋法）。2）環(huán)磷酰胺注射液（CTX），由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：06111521。

1.3.2 試劑 抗CD4-藻紅蛋白（PE）和抗CD8-異硫氰酸熒光素（FITC）單抗，小鼠白介素-2（IL-2）試劑盒和小鼠白介素-4（IL-4）試劑盒（為深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品）。

1.4 儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（anthos 2010 17750，Austria）；微量加樣器（SOCOREX，瑞士）；FACSCALIBUR流式細(xì)胞儀（BD公司,美國(guó)）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；低溫超速離心機(jī)（KDC-160HR，安徽，合肥）等。

1.5 動(dòng)物模型的制備 無菌取第8天轉(zhuǎn)移癌H22腹水（計(jì)活細(xì)胞大于95%），用0.9%生理鹽水稀釋成2×106個(gè)/mL，取健康純系昆明種小鼠40只，18～22 g（6周齡），雌雄各半，每只鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2mL瘤細(xì)胞懸液，然后將荷瘤鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只（雌雄各半），分別為模型組、實(shí)驗(yàn)組、環(huán)磷酰胺組和聯(lián)合用藥組，另取10只未接種荷瘤的小鼠（雌雄各半）作為正常對(duì)照組。

1.6 動(dòng)物分組及給藥方法 正常對(duì)照組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；模型組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；實(shí)驗(yàn)組：白附子混懸液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；環(huán)磷酰胺組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30 mg/(g·d)]0.2 mL；聯(lián)合用藥組：白附子混懸液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30mg/（kg·d）]0.2mL。

以上各組均從實(shí)驗(yàn)第2天開始給藥，每日1次，連續(xù)10 d。稱質(zhì)量后，眼球取血，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡消毒后剝離瘤組織。

1.7 測(cè)定方法

1.7.1 小鼠外周血IL-2水平的測(cè)定 原理：酶標(biāo)雙抗體夾心法。1）小鼠眼球取血，置于離心管中，分離血清（3 000 r/min，離心 5min）。2）從密封袋中取出所需板條，平衡至室溫。3）除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（每孔100μL）加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90min，洗板4次。4）除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育60min，洗板4次。5）除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育 30 min，洗板4次。6）加入顯色劑（每孔100μL），避光37℃孵箱顯色15min，加入終止液（每孔100μL），混勻后即刻測(cè)量OD492值（5min內(nèi)）。

1.7.2 小鼠外周血IL-4水平的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)原理、方法基本同于IL-2測(cè)定。

1.7.3 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）法測(cè)定T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+細(xì)胞亞群 取抗凝血100μL放于試管中，分別加入抗CD4-藻紅蛋白（PE）和抗CD8-異硫氰酸熒光素（FITC）單抗各 10μL，置室溫避光 20min，加入紅細(xì)胞裂解液2mL，離心棄上清液，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗液2mL混勻，離心后棄上清液，加入固定液600μL，4℃存放至少30min后，流式細(xì)胞儀測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4的影響 見表1。模型組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），結(jié)果接近正常對(duì)照組水平（P>0.05）。環(huán)磷酰胺組的IL-2水平與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而 IL-4水平低于模型組（P<0.01），表明CTX（環(huán)磷酰胺注射液）對(duì)荷瘤小鼠IL-2的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用，且有較強(qiáng)的抑制作用。聯(lián)合用藥組IL-2水平與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明兩藥合用后能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，降低CTX(環(huán)磷酰胺注射液)的免疫抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全糾正。

表1 白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影響（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

表1 白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影響（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01。

組別 n正常對(duì)照組 10模型組 10實(shí)驗(yàn)組 10環(huán)磷酰胺組 10聯(lián)合用藥組 10 IL-2（ng/L） IL-4（ng/L）164.47±10.95 101.36± 6.21 114.68±11.09** 133.21±10.22**158.10± 8.66▲▲ 99.80± 7.56▲▲112.48±11.25** 93.97± 4.77▲▲130.95±15.11**▲▲ 94.88± 6.69▲▲

2.2 白附子混縣液對(duì)H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細(xì)胞的影響 見表2。模型組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)組與模型組比較差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），結(jié)果接近正常對(duì)照組水平（P>0.05），能夠使 CD4+細(xì)胞回升，CD8+細(xì)胞有所回落，明顯改善CD4+/CD8+的失衡狀態(tài)。環(huán)磷酰胺組與正常對(duì)照組和模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞均明顯降低。聯(lián)合用藥組的CD8+細(xì)胞水平接近正常對(duì)照組（P>0.05），CD4+細(xì)胞水平與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明兩藥合用能夠部分改善環(huán)磷酰胺的抑制作用，調(diào)節(jié)機(jī)體CD4+/CD8+失衡狀態(tài)。

表2 白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細(xì)胞的影響（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

表2 白附子混懸液對(duì)H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細(xì)胞的影響（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01。

組別 n正常對(duì)照組 10模型組 10實(shí)驗(yàn)組 10環(huán)磷酰胺組 10聯(lián)合用藥組 10 CD4+細(xì)胞 CD8+細(xì)胞 CD4+/CD8+46.09±2.07 22.62±1.68 2.05±0.22 40.00±1.65** 28.86±1.58** 1.39±0.09 45.19±0.90▲▲ 24.00±1.24▲▲ 1.92±0.11 37.17±1.52**▲▲ 17.92±1.22**▲▲ 2.08±0.15 40.62±1.89** 22.64±2.31▲▲ 1.81±0.23

3 討論

荷瘤小鼠外周血T細(xì)胞亞群比例出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞增多，這些變化可以通過CD4+/CD8+比值得到更敏感的反映。即荷瘤機(jī)體CD4+/CD8+比值下降，小鼠機(jī)體免疫功能減弱。CD4+T細(xì)胞可分化為TH1細(xì)胞和TH2細(xì)胞，其誘導(dǎo)因素有：由感染引發(fā)的細(xì)胞因子[主要是干擾素（IFN）-γ、IL-12和IL-4]、啟動(dòng)免疫應(yīng)答的協(xié)同刺激信號(hào)以及肽-主要組織相容性復(fù)合物（MHC）的性質(zhì)。IL-4可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化成TH2。模型組荷瘤小鼠IL-2水平明顯下降，IL-4水平明顯升高，說明荷瘤小鼠免疫功能處于紊亂狀態(tài)，TH2細(xì)胞相對(duì)處于優(yōu)勢(shì)地位，抑制了抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答TH1細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)。

用白附子混懸液治療后，能使荷瘤小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)增加，CD8+T細(xì)胞表達(dá)降低，可以明顯改善CD4+/CD8+比值的失衡狀態(tài)，恢復(fù)機(jī)體正常的免疫狀態(tài)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。同時(shí)白附子混懸液能夠促進(jìn)荷瘤小鼠IL-2的表達(dá)，使IL-4水平有所下降，使荷瘤小鼠的IL-2、IL-4水平接近正常對(duì)照組，說明白附子混懸液能夠促進(jìn)荷瘤小鼠TH1型細(xì)胞因子的表達(dá)，使荷瘤小鼠由TH2型細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)狀態(tài)向TH1型逆轉(zhuǎn)，糾正TH1/TH2漂移，從而增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，提高荷瘤機(jī)體的抗腫瘤能力。

白附子混懸液與CTX合用后，CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞均有所回升CD8+細(xì)胞水平接近正常對(duì)照組，說明兩藥合用能夠部分改善CTX對(duì)荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫抑制作用，調(diào)節(jié)機(jī)體CD4+/CD8+的失衡狀態(tài)。同時(shí)能使IL-2表達(dá)水平提高，說明兩藥合用后能夠調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體的免疫狀態(tài)，降低CTX對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞免疫的抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全糾正。

綜上，白附子混懸液可以改善荷瘤機(jī)體CD4+/CD8+的失衡狀態(tài)，促進(jìn)IL-2等TH1型細(xì)胞因子的表達(dá)，糾正荷瘤機(jī)體TH1/TH2漂移，提高荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

[1]孫 燕，趙 平.臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2005：3－8.

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The immuneadjustmentmechanism ofanti-tumor efficacy of SGTR on H22tumor bearingm ice

YUXiao-hong1,SONGNa1,HUYan-wen2
(1.DepartmentofMicrobiology and Immunology,Heilongjiang University of TCM,Harbin 150040,China;2.Maternaland Child Health Hospitalof Tianjin Tanggu District,Tianjin 319000,China)

[Objective]Study the adjustment function of SGTR on the immune system of tumor-bearingmice and investigate the immunologicalmechanism of the inhibition function ofSGTR on tumor’sgrowth.[Methods]H22tumorbearingmicewere as the research object.Wemeasured the levels of IL-2 and IL-4 in serum with ELISA method,and the influence of SGTR on CD4+、CD8+T cell with FACS method.[Results]SGTR can improve the expression of IL-2 cytokines in H22tumorbearingmice's serum,lower the levelof IL-4,increase the expression ofCD4+T cells,and reduce the expression ofCD8+T cells in H22tumorbearingmice.[Conclusion]SGTR could play a role ofanti-tumoractivity by regulating the body’sabnormal immune function in tumor-bearing state.

SGTR;H22cells;immune regulation

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0326-03

黑龍江省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（GOOC201301）。

于曉紅（1958-），女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥抗腫瘤的免疫學(xué)研究。

2011-04-26）