痹痛靈顆粒對(duì)肺痹類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎肺組織IL-17 mRNA表達(dá)的影響

樊任珠 汪 悅 徐建亞 桑 鋒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇省南京市棲霞區(qū)仙林大道138號(hào)南京中醫(yī)藥大學(xué)E3-304室，210046)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，多種免疫細(xì)胞因子失調(diào)可導(dǎo)致微血管新生而形成血管翳［1］。痹痛靈顆粒為名老中醫(yī)汪履秋經(jīng)驗(yàn)方，多年來(lái)臨床應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著的臨床療效［2］。本研究通過(guò)建立大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察痹痛靈對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠肺組織微血管密度及IL-17表達(dá)的影響，探討其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗血管新生的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wister大鼠，清潔級(jí)，4～6周齡，平均體重為(180±15)g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)。

1.2 主要儀器 TP 1020自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，RM2135型石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，Tissue-Tek TEL組織包埋中心(日本SAKURA公司產(chǎn)品)，Minisee病理圖像采集系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析儀(LightCycle Roche公司)。

1.3 主要試劑 Rabbit anti FⅧ即用型快速免疫組化試劑(福州邁新生物公司RAB-0070)，引物和探針(上海生工生物工程有限公司);痹痛靈顆粒浸膏(組成:麻黃、桂枝、制川烏、蜈蚣、桃仁等)，雞 II型膠原(上海本草生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，雷公藤多苷片(10mg/片，恒生藥業(yè)有限公司)，博來(lái)霉素(日本化藥株式會(huì)社)。

2 方法

2.1 膠原性關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)及肺纖維化模型 參考文獻(xiàn)［3-4］進(jìn)行。

2.2 分組及處理 60只大鼠隨機(jī)選取10只為正常組，另50只造模，共成模40只，隨機(jī)分為5組各8只。正常組與模型組均給予等容量蒸餾水;痹痛靈高、中、低劑量組分別給予痹痛靈顆粒14g生藥/kg、7g生藥/kg、3.5g生藥/kg體重;雷公藤組給予雷公藤多苷片9mg/kg體重。各組均于造模第21天開(kāi)始給藥，1次/d，共給藥 15d。

2.3 組織標(biāo)本的采集與處理方法 給藥3周后將動(dòng)物處死，留取肺組織標(biāo)本。

2.4 肺組織病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，根據(jù) Szapiel［5］等方法，肺泡炎和纖維化程度各分為4級(jí):無(wú)肺泡炎(0)，輕度肺泡炎(1)，中度肺泡炎(2)，重度肺泡炎(3)。

2.5 肺組織血管密度計(jì)數(shù)(MVD)免疫組化過(guò)程［6］采用快速免疫組化方法，寧闕圖形分析系統(tǒng)下定量觀察，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色。400倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的數(shù)目。

2.6 RealTime-PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank發(fā)布序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使上下游引物跨越2個(gè)內(nèi)含子，以排除DNA干擾，經(jīng)NCBIBLAST檢索無(wú)顯著同源性序列，內(nèi)對(duì)照為β-actin，IL-17 Sense primer:tgagagttgacattcgcatctt，Antisenseprimer: gatacagcctgagtgtctgcac，Product size160。

表1 各組大鼠肺泡炎程度比較

表2 各組大鼠肺組織MVD的相對(duì)數(shù)量

表3 各組大鼠肺組織IL-17 mRNA基因的相對(duì)含量(ˉx±s)

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)值變量以ˉx±s表示，15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。RealTime-PCR實(shí)驗(yàn)采用比較2-△△Ct法分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺泡炎同程度比較 見(jiàn)表1。各給藥組肺泡炎都有不同程度減輕，與模型組比較，統(tǒng)計(jì)差異有顯著性。

3.2 各組大鼠肺組織MVD的相對(duì)數(shù)量 見(jiàn)表2。各給藥組動(dòng)物MVD均低于模型組，且以痹痛靈高、中劑量組和雷公藤多苷片組效果較為顯著，與模型組比較，差異有顯著性。

3.3 各組大鼠肺組織膜組織IL-17 mRNA的相對(duì)含量 見(jiàn)表3。痹痛靈高中劑量組和雷公藤多苷片組比模型組IL-17在肺組織中表達(dá)≥2倍，基因表達(dá)降低。

4 討論

RA主要病理變化為滑膜血管新生、細(xì)胞增殖，多種細(xì)胞因子參與了這一過(guò)程。病變的血管新生主要取決于促血管生長(zhǎng)因子和抑制血管生長(zhǎng)因子間的平衡［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CIA大鼠肺組織病理過(guò)程中MVD和細(xì)胞因子IL-17 mRNA水平增高，RA的血管新生有多種細(xì)胞因子參與，IL-17是前細(xì)胞因子主要由活化的記憶性CD+4T淋巴細(xì)胞分泌，是一種血管生成調(diào)節(jié)因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管素形成，并上調(diào)多種血管形成因子表達(dá)，有促血管生成作用［8］。IL-17還與其他炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β等產(chǎn)生協(xié)同作用，可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，導(dǎo)致血管新生，關(guān)節(jié)破壞加重［9］。

痹痛靈主要用散寒祛濕，祛瘀通絡(luò)法治療RA，用于臨床療效確切。方中麻黃可散寒通滯、發(fā)汗解表，桂枝可溫通經(jīng)脈、發(fā)汗解肌。麻黃、桂枝配伍具有協(xié)同作用。川烏、蜈蚣藥理研究均有解熱、鎮(zhèn)痛作用。桃仁可活血祛瘀。本研究表明痹痛靈能明顯下調(diào)模型大鼠肺組織中MVD和IL-17 mRNA相對(duì)含量，從而可能發(fā)揮抗血管新生等作用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺部病變。

［1］徐育冬，靳洪濤.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與促血管新生的細(xì)胞因子.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2007，10(11):633-635.

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