GDF-8干擾質粒轉染綿羊耳成纖維細胞最佳條件研究

靳 輝，黃 洋，岳文斌，張曉強，張春香

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

1997年，美國John Hopkins大學的McPherron等[1]從小鼠骨骼肌cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一種新的生長分化因子（Growthand Differentiation Factor，GDF），該因子只有1個可讀框，可編碼376個氨基酸，具有轉化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）家族的典型特征，但通過與TGF-β家族其他成員比較，其與TGF-β家族其他成員的同源性很低，最高僅為45%，因而列為TGF-β家族的一類因子——GDF-8。就C端而言，GDF-8基因在不同物種間十分保守，大鼠、人、豬、雞、火雞、小鼠的同源性達100%[2]。

GDF-8是一種對骨骼肌生長具有負調控作用的重要細胞因子，GDF-8基因的突變或缺失會導致肌肉細胞的增生和肌纖維的肥大，該基因敲除的動物具有生長速度快、肌肉含量高、脂肪含量少的特點[1]。利用基因敲除技術研究GDF-8功能時發(fā)現(xiàn)，敲除GDF-8基因的小鼠骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，但在其他生長發(fā)育性狀上沒有發(fā)現(xiàn)任何表現(xiàn)型的差異[1]。GDF-8基因自然突變的雙肌?！壤麜r藍牛[3]，其肌肉數(shù)量較一般品種多20%左右，而且肉質鮮嫩，極大地提高了飼料轉化效率。因此，建立敲除GDF-8基因的轉基因動物具有廣闊的應用前景。

本試驗采用脂質體轉染法，用紅色熒光蛋白（RFP）標記的GDF-8基因干擾質粒轉染綿羊耳成纖維細胞，探索其最佳轉染條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表達載體與菌種 紅色熒光蛋白標記的GDF-8基因干擾質粒和大腸桿菌DH5α為山西農業(yè)大學動物科技學院遺傳育種與繁殖實驗室保存。

1.1.2 試劑 DMEM/F12（Boster），胎牛血清，胰蛋白酶（Solarbio），雙抗（Sigma），LipofectamineTM2000（invitrogen），Opti-MEM（GIBCO）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)液的配制 在DMEM/F12中添加10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗所構成的培養(yǎng)基（簡稱基本培養(yǎng)基）用于綿羊耳成纖維細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在DMEM/F12中添加10%FBS，所構成的培養(yǎng)基（簡稱無抗培養(yǎng)基）用于GDF-8基因干擾質粒的轉染。

1.2.2 靶細胞的培養(yǎng) 取1周齡綿羊新鮮耳組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行原代、傳代培養(yǎng)和凍存，建立綿羊耳成纖維細胞系[4-7]，為脂質體介導的GDF-8基因干擾質粒轉染提供靶細胞。

1.2.3 脂質體法介導轉靶細胞 將傳至4代已經(jīng)純化的耳成纖維細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)為10 000個。待細胞匯合至70%～80%時，將基本培養(yǎng)基換為無抗培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基24 h后，細胞匯合度已達到90%，按如下步驟進行GDF-8基因干擾質粒的轉染：（1）將不同量的質粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6 μg） 和不同量的LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5 μL）分別稀釋于25μL的Opti-MEM中。然后，將稀釋好的不同量質粒DNA和不同量的LipofectamineTM2000兩兩混合，室溫擱置20min，構成轉染液，加入一個培養(yǎng)孔中，每個組合重復3個孔，12 h后更換為基本培養(yǎng)基。48 h熒光倒置顯微鏡下檢測每個組合表達紅色熒光蛋白的陽性細胞數(shù)，用以篩選最佳質粒DNA用量和最佳LipofectamineTM2000用量。檢測時每個轉染處理組隨機選取5個視野，檢測表達紅色熒光蛋白的陽性細胞數(shù)，計算每個處理組的陽性細胞數(shù)平均值。（2）用篩選出的最佳質粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量構成轉染液，分別于 3，6，12，24，48 h 后更換為基本培養(yǎng)基，每個時間重復3次。48 h熒光倒置顯微鏡下檢測不同轉染時間的陽性細胞數(shù)，用以篩選最佳轉染時間。檢測方法同（1）。

2 結果與分析

2.1 轉染的最佳質粒DNA用量和脂質體用量

試驗結果表明，當DNA用量為0.4μg，脂質體用量為1.0μL時，不同時間觀察轉染效率均較高。不同時間觀察的轉染效果如圖1所示。

48 h計算5個視野平均陽性細胞數(shù)，結果如表1所示。

2.2 轉染的最佳時間

用篩選出來的最佳質粒DNA量0.4μg和脂質體量1.0μL轉染綿羊耳成纖維細胞，計算不同時間后的陽性細胞數(shù)，結果表明，轉染時間為6 h時，可以獲得較高的轉染效率（表2）。

表1 48 h不同質粒DNA量和不同脂質體量轉染5個視野平均陽性細胞數(shù) 個

表2 不同轉染時間對轉染效果的影響

3 討論

3.1 紅色熒光蛋白（RFP）和陽離子脂質體法

本試驗采用紅色熒光蛋白（RFP）標記GDF-8基因干擾質粒，RFP在靶細胞內表達，可以直接在熒光倒置顯微鏡下觀察，便于識別轉染陽性細胞，因此，RFP作為一種理想的標記物應用于轉基因領域。目前，陽離子脂質體法常作為轉染外源基因的手段[8]。研究發(fā)現(xiàn)，多種脂類可以在合適的條件下形成小的單層陽離子脂質體，這些脂質體的表面帶有正電荷，能被DNA的磷酸根所吸附，同時也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，通過細胞融合或胞吞作用使脂質體和DNA復合物進入細胞質，最終進入細胞核并使外源基因整合到染色體中進行基因的表達[9]。由于不同類型的細胞吸收大小各異顆粒的能力不盡相同，針對不同細胞類型以及所介導的核酸（DNA，RNA或核苷酸），選擇合適的脂質體是十分重要的。LipofectamineTM是一種新型脂質體，其獨特的精胺基團強正電子頭部可以同時與帶負電的DNA和細胞形成復合物，大大提高了轉染效率。LipofectamineTM作為載體在體內外基因轉染的研究中已有很多文獻報道[10]。該方法具有高效、簡便、對細胞損傷小和容易重復等優(yōu)點。

3.2 影響轉染效果的各種因素

本試驗探討了LipofectamineTM2000介導的GDF-8基因干擾質粒轉染綿羊耳成纖維細胞的最佳轉染條件。首先在轉染前24 h，將含抗生素的基本培養(yǎng)基更換為無抗生素的無抗培養(yǎng)基，因為在抗生素存在的情況下不利于轉染。另外，試驗探索了轉染時的最佳質粒DNA和脂質體用量以及最佳轉染時間，由于不同細胞達到最佳轉染效果時所用的DNA量和脂質體量是不同的。由本試驗結果可知，當脂質體量一定時，轉染效率會隨DNA量的增加而增加，但有一個最大值，超過這個最大值時轉染效率降低。當DNA量一定時，轉染效率會隨脂質體量的增加而增加，但也有一個最大值，超過最大值后轉染效率也會降低。因為高濃度的脂質體對細胞有毒性，會導致細胞萎縮、死亡。此外，轉染時間一定程度上也影響著轉染效率的高低。以上結果表明，DNA和脂質體用量以及轉染時間會影響轉染效率，欲提高轉染效率還有待進一步研究。

4 結論

用GDF-8基因干擾質粒轉染綿羊耳成纖維細胞的最佳轉染條件為：DNA用量為0.4μg，脂質體用量為1.0μL，轉染時間為6 h。

［1］ McPherron AC，LawlerAM，Lee SJ，etal.Regulation ofskeletal musclemass in mice by a new TGF-βsuperfamilymember[J].Nature，1997，387（6628）：83-90.

［2］ Alexandra CMcPherron，Se-Jin Lee.Doublemuscling in cattle due tomutations in themyostatin gene[J].Proc Natl Acad Sci，1997，94（23）：1457-1461.

［3］ Grobet L，Mani I J，Poncelet D，et al.A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J].NatGenet，1997，17（1）：71-74.

［4］ 李桂芳，李巖，趙宗勝，等.綿羊耳成纖維細胞的體外培養(yǎng)[J].中國草食動物，2003，23（4）：5-7.

［5］ 萬發(fā)春，劉曉牧，宋恩亮，等.用于保種的蒙山牛耳成纖維細胞的培養(yǎng)研究[J].華北農學報，2009，24（增刊）：109-112.

［6］ 王亮，劉婷婷，彭濤.荷斯坦奶牛耳組織成纖維細胞分離培養(yǎng)及冷凍保存方法研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（5）：9-11.

［7］ 關偉軍，馬月輝.小尾寒羊耳組織成纖維細胞系的建立與生物學特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2005，36（5）：511-516.

［8］ Raniere R Oliveira.Effectiveness of liposomes to transfect livestock fibroblasts[J].GMR，2005，4（2）：185-196.

［9］ 胡義德，高鋪.Fugene-6，一種介導體外真核細胞高效率基因轉染的新方法[J].免疫學雜志，2001，17（2）：138-140.

［10］ Madry H，Reszka R，Bohlender J，et al.Efficacy of cationic liposome-mediated gene transfer tomesangial cells in vitro and in vivo[J].JMo1Med，2001，79（4）：184-189.