熱休克蛋白70對LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷的影響

牛 利， 許瑞齡 (山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 太原 030001)

在各型急慢性肝損傷、酒精性肝病及急性肝衰竭過程中TNF-α作為炎性細(xì)胞因子扮演了重要的角色，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)重型肝炎患者血清TNF-α水平明顯升高［1］。TNF-α是引起肝損傷的重要促炎細(xì)胞因子，可由LPS誘導(dǎo)枯否細(xì)胞產(chǎn)生，在急性肝損傷發(fā)病過程中起著非常重要的作用。近年來，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)在適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)中的作用日益受到重視。據(jù)報(bào)道，亞砷酸鈉(sodium arsenite，SA)可誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生熱休克反應(yīng)，使組織和細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致熱休克蛋白特別是HSP70的產(chǎn)生［2］。細(xì)胞受到輕度刺激后，HSP70可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)整相關(guān)蛋白的合成，改變細(xì)胞的代謝和功能，以減輕有害刺激所致的損傷。為此本實(shí)驗(yàn)利用腹腔注射SA誘導(dǎo)肝臟HSP70表達(dá)，通過HSP70對肝損傷中TNF-α的影響來探討HSP70保護(hù)肝臟的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物，試劑及儀器 雄性昆明種小鼠70只，體重(25±2.9)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。內(nèi)毒素(LPS)購自Sigma公司;亞砷酸鈉:購自湖南水口山礦務(wù)局衡陽實(shí)業(yè)總公司;TNF-α放免試劑盒:購自北京解放軍總醫(yī)院;Re-24型SORALL低溫超速離心機(jī):美國Du Pont公司;TNF-α和HSP70羊抗鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗羊二抗購自北京中杉生物技術(shù)公司。Marker購自美國 Amershammacio Biotch公司;PVDF膜購自美國Milipore公司。DYY-Ⅲ8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀、DYY-Ⅲ7B型轉(zhuǎn)移電泳儀:北京六一儀器廠。UV-2102型分光光度計(jì):尼龍柯(上海)儀器有限公司。

1.2 動物分組和處理 雄性昆明種小鼠70只，習(xí)服飼養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)前1 d下午禁食，飲水不限，將小鼠隨機(jī)分為:對照組(n=10)，0.9%NaCl 0.2 ml/只腹腔注射;LPS組(n=30)，LPS溶于生理鹽水，劑量為5 mg/kg，腹腔注射一次;SA預(yù)處理組(n=30)，SA溶于無菌生理鹽水，8 mg/kg于前一晚8:00腹腔注射一次，12 h后腹腔注射LPS，劑量和處理與LPS組相同。各組動物分別于處理后0.5 h(n=10)、1.5 h(n=10)、6 h(n=10)，在戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉下經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈采血、開腹取肝。肝組織用鋁薄紙包裝，液氮速凍后－70℃冰箱冷凍保存。

1.3 方法 用Western blot方法檢測肝臟HSP70，TNF-α蛋白的表達(dá);按照改良金氏法測定血漿ALT活性;用放射免疫法測定肝勻漿中TNF-α的含量。1.3.1 各組取凍存的肝組織200 mg，置液氮研碎，轉(zhuǎn)入勻漿器中加入RIPA(用前加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)裂解液后勻漿，12 500×g，4℃離心20 min，取上清。肝組織細(xì)胞核蛋白按Essani方法提取。Bradford法測定蛋白含量。取等量蛋白(20 μg)加樣，以4%濃縮膠，10%分離膠(測HSP70)和15%分離膠(測 TNF-α)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)補(bǔ)充其濃度。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印跡至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜過夜后經(jīng)5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，1×TBST緩沖液漂洗(3次，10 min/次)，然后分別加入1∶1 000的相應(yīng)蛋白抗體，4℃搖蕩過夜。次日用1×TBST漂洗3次后，再加入1∶2 000的針對一抗種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u蕩2 h，1×TBST漂洗3次。然后在暗室內(nèi)將膜置入ECL發(fā)光液1－2 min，用PE保鮮膜包蓋PVDF膜，置于X線膠片下曝光、顯影和定影。將定影后的X線片圖像用掃描儀轉(zhuǎn)化為數(shù)碼圖像，用 Quantity One(Bio-Rad)4.52軟件，進(jìn)行圖像分析處理，獲取圖像光密度值(A)。

1.3.2 取6 h的內(nèi)眥靜脈血液離心后取血清100 μl，加入谷丙基質(zhì)液 0.5 ml，置于37 ℃水浴30 min，后每管加入2，4－二硝基甲苯0.5 ml，37℃水浴20 min 加入 0.4 mol/L NaOH 5.0 ml混勻于520 nm 光電比色。

1.3.3 取凍存的1.5 h的肝組織100 mg加入 pH 7.4的磷酸鹽緩沖液1 ml，勻漿機(jī)上攪碎。按TNF-α試劑盒說明書測定肝勻漿中TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值均以±s表示。One-way ANOVA進(jìn)行多樣本均數(shù)的比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的兩兩比較(α =0.05)。

2 結(jié)果

LPS注射后0.5 h肝臟HSP70達(dá)到表達(dá)高峰，隨著時(shí)間推移其表達(dá)逐漸減弱;而經(jīng)SA預(yù)處理動物肝臟HSP70表達(dá)在上述3個時(shí)間點(diǎn)均較LPS組明顯增強(qiáng)(P ＜0.05，見圖 1、表1)。LPS組 TNF-α表達(dá)在3個時(shí)間點(diǎn)較對照組明顯升高，而經(jīng)SA預(yù)處理動物肝臟TNF-α表達(dá)在0.5 h和1.5 h雖較對照組高，但較LPS組明顯減少(P＜0.05，見圖2和表1)。SA預(yù)處理 TNF-α在6 h仍較 LPS組減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖2和表1)。

圖1 小鼠肝臟HSP70的Western blot分析Fig 1 The expression of HSP70 in the liver of mice by Western blot

圖2 小鼠肝臟TNF-α的Western blot分析Fig 2 The expression of TNF-α in the liver of mice by Western blot

表1 小鼠肝臟HSP70，TNF-α在不同肝損傷時(shí)間的表達(dá)結(jié)果Tab 1 The expression of HSP70 and TNF-α in the liver of mice at different time points after LPS-induced hepatic injury

LPS所致肝損傷組血漿ALT活性較對照組顯著升高(P＜0.01)，而SA預(yù)處理組的ALT活性明顯低于肝損傷組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。肝損傷組TNF-α水平明顯高于對照組(P＜0.05)，SA組TNF-α水平雖高于對照組但卻明顯低于肝損傷組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

表2 各組ALT，TNF-α的含量比較Tab 2 The contents of ALT and TNF-α in different groups at 6 h

3 討論

HSP是生物體在不利環(huán)境因素刺激下應(yīng)激合成的一組特殊的蛋白質(zhì)。它可以使細(xì)胞進(jìn)入保護(hù)狀態(tài)，特別是HSP70的產(chǎn)生可使細(xì)胞對致死性的損傷產(chǎn)生抵抗。誘導(dǎo)型HSP70的主要功能是發(fā)揮分子伴侶作用［3］及調(diào)控炎癥因子釋放作用［4］，可以保護(hù)細(xì)胞線粒體免遭活性氧化產(chǎn)物的攻擊、抑制促炎癥因子如TNF-α、IL-1等誘導(dǎo)的呼吸爆發(fā)［5］。細(xì)胞受到輕度刺激后，HSP70可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)整相關(guān)蛋白的合成，改變細(xì)胞的代謝和功能，以減輕有害刺激所致的損傷，HSP70參與此項(xiàng)調(diào)節(jié)過程，并可增強(qiáng)細(xì)胞對損害的耐受力。本實(shí)驗(yàn)用SA預(yù)處理誘導(dǎo)HSP70的合成來抵御LPS誘導(dǎo)的肝損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SA 預(yù)處理組HSP的含量在0.5 h，1.5 h，6 h三個時(shí)間點(diǎn)都明顯高于LPS組(P＜0.05)，說明SA預(yù)處理可增加HSP70的表達(dá)。在急性肝損傷時(shí)，血漿ALT水平的升高在2 h后12 h前［6］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇測定肝損傷后6 h血漿ALT的水平。結(jié)果顯示，肝損傷組ALT明顯高于對照組及SA預(yù)處理組，說明增加HSP70的表達(dá)對肝損傷具有保護(hù)意義。

腫瘤壞死因子是具有多種生物活性的多肽調(diào)節(jié)因子，適量的TNF-α可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，對維持機(jī)體的正常穩(wěn)定狀態(tài)及抵御各種致病因子有著重要的作用。而TNF-α的異常分泌又可作為機(jī)體炎癥、損傷和休克的重要炎性介質(zhì)，參與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程。肝臟富含TNF-α受體，且具有高親和力，是TNF-α的重要靶點(diǎn)，對TNF-α的毒性具有高度敏感性，它與肝臟炎癥活動性及肝細(xì)胞壞死程度密切相關(guān)［7］。TNF-α可通過激活磷酯酶 A，引起炎細(xì)胞的聚集、滲出和浸潤，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性損傷;也可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng);另外，它還可通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的活化，產(chǎn)生更多的氧自由基，形成惡性循環(huán)，加重肝損傷。熱應(yīng)激或亞砷酸鹽預(yù)處理肺泡巨噬細(xì)胞，可明顯減少巨噬細(xì)胞受LPS刺激后分泌的TNF-α水平，而且可能是通過誘導(dǎo)HSP70以翻譯水平來調(diào)節(jié)LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞分泌的 TNF-α［8］。本實(shí)驗(yàn)在 0.5 h，1.5 h，6 h三個時(shí)間點(diǎn)SA預(yù)處理組TNF-α的水平均顯著低于損傷組(P＜0.05);而急性肝損傷時(shí)，TNF-α的分泌高峰在1 h后［6］，因此本文選擇測定損傷后1.5 h肝勻漿中TNF-α的含量，結(jié)果顯示，肝損傷組TNF-α的含量明顯高于對照組，而SA預(yù)處理組肝勻漿TNF-α水平明顯低于肝損傷組(P＜0.05)，提示SA誘導(dǎo)肝臟HSP70表達(dá)可減少肝損傷中TNF-α的釋放，以減輕TNF-α對肝臟的損傷作用。

綜上所述，SA預(yù)處理可誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生HSP70，在LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中，可通過降低TNF-α的含量來達(dá)到減輕肝臟炎癥反應(yīng)，減弱肝損傷的程度。

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