白血病的分子生物學(xué)診斷研究進展

張耀輝

(淄博市中心醫(yī)院，山東淄博，255036)

白血病是一類常見和多發(fā)的造血干細胞克隆性惡性疾病，形態(tài)學(xué)分型為其主要診斷方法，但對于一些形態(tài)不典型的病例易誤診。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，大部分的白血病存在著某種染色體易位，而易位會產(chǎn)生新的融合基因、癌基因的擴增、原癌基因點突變或抑癌基因的失活等。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白血病的基因診斷已成為研究熱點，現(xiàn)將其研究進展綜述如下。

1 診斷策略

基因診斷是利用分子生物學(xué)的技術(shù)方法檢測受檢者體內(nèi)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)或者水平的變化，從而對疾病作出診斷的方法［1］。與傳統(tǒng)方法相比較，其具有非常顯著的優(yōu)越性，既可以直接對個體基因狀態(tài)進行檢測，又可以對表型正常的攜帶者以及特定疾病的易感者作出診斷和預(yù)測［2］。

在分子水平診斷白血病主要針對特定的染色體易位和易位形成的融合基因，如急性非淋巴細胞白血病(ANLL)M2b型存在AML1/ETO融合基因，為t(8;21)(q22;q22)易位所產(chǎn)生;M3型存在PML/RARα融合基因，是t(15;17)(q22;q21)易位所產(chǎn)生的;慢性粒細胞性白血病(CML)存在的bcr/abl融合基因由t(9;22)(q34;q11)易位所產(chǎn)生的;急性淋巴細胞白血病(ALL)則存在IgH、TCRγ、TCRδ等基因重排。髓系細胞白血病和急性淋巴細胞白血病的重排基因以及融合基因為分子生物學(xué)診斷白血病提供了分子靶標，使其能有效進行白血病的分型診斷、微小殘留病(MRD)的監(jiān)測及療效評價［3］。

2 診斷方法

2.1 熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 目前FISH廣泛用于檢測染色體重組和標記染色體，檢測多種基因疾病的染色體微缺失和用于非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷［4，5］。其基本原理是用標記了熒光素、生物素或者地高辛的單鏈DNA探針和與其互補的DNA退火雜交，通過檢測附著在玻片上的分裂中期或間期細胞上的核DNA位置反映相應(yīng)基因的狀況。適用于多種臨床標本(如血液、骨髓、組織印片和體液，甚至石蠟包埋的組織標本等)，具有直觀、方便、敏感、可量化、方法多樣和適應(yīng)不同檢測目的等優(yōu)點，目前在血液學(xué)領(lǐng)域中得到越來越廣泛的應(yīng)用，尤其是在白血病診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后評估和微小殘留病檢測等諸方面為不可缺少的重要手段。

目前，可通過檢測已經(jīng)被克隆的染色體易位累及的融合基因?qū)Π籽∵M行分子診斷。常見的單一序列探針有PML/RARα、AML1/ETO、BCR/ABL和 TEL/AML1等。但是為了方便起見，商品化的探針可為多標記的，即兩個基因分別用兩種顏色進行標記，同時在一張玻片標本上進行雜交，可大大提高檢測效率。間期FISH技術(shù)檢測的是單個細胞水平上的染色體異常，可提供白血病負荷的數(shù)量指標，且可反映各期細胞的白血病殘留狀態(tài)，因此在國際上被廣泛運用。杜慶鋒等［6］應(yīng)用雙色雙融合間期熒光原位雜交(D-FISH)探針對移植后或經(jīng)供者淋巴細胞輸注治療獲完全細胞遺傳學(xué)緩解的慢性粒細胞白血病患者骨髓內(nèi)殘留的微小腫瘤負荷水平進行檢測，結(jié)果顯示D-FISH具有很好的靈敏度及特異性，可重復(fù)性高，并且檢測到的陽性結(jié)果與RT-PCR結(jié)果高度相關(guān)。

2.2 實時熒光定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)RQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)的PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光標記探針，然后通過熒光定量PCR儀檢測PCR過程中熒光強度的變化情況，再根據(jù)標準品的Ct值(即PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù))來建立標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其具有靈敏、特異、技術(shù)成熟和操作簡便等優(yōu)點，檢測白血病融合基因結(jié)果準確穩(wěn)定，對于臨床上明確診斷、具體分型、動態(tài)觀測腫瘤負荷、選擇合適治療方案、評估治療效果和預(yù)后都有較大價值。姜艷梅等［7］對RQ-PCR進行了方法學(xué)評價，在應(yīng)用其檢測急性髓系白血病AML1/ETO融合基因時，結(jié)果顯示6例陰性AML1/ETO融合基因標本均呈現(xiàn)陰性，說明其特異性好，可重復(fù)性高。Uckun等［8］在用不同方法檢測ALL患兒的t(4;11)染色體易位時發(fā)現(xiàn)，RQ-PCR既具有較核型分析和巢式RT-PCR更高的敏感性，又可定量分析。

2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是將大量探針有序地固定在固相支持物上，與待測樣本中的多種類核酸按堿基配對原則進行雜交，再通過電子計算機控制點樣和圖像掃描硬件及軟件分析，迅速得出待測樣本生物信息的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)果的方法。其優(yōu)越性為能夠在基因表達水平上對腫瘤進行更精確的分型分類，并可預(yù)測腫瘤的治療效果和預(yù)后。

隨著人類基因組測序的完成，借助基因芯片技術(shù)，目前可得到不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)錄基因表達譜(GEP)。近年來，應(yīng)用基因芯片技術(shù)進行白血病的GEP研究報道較多，但用于臨床診斷的基因芯片尚未問世，仍處于研究探索階段。目前一個國際性腫瘤合作研究組(MILE)正在對基因芯片在白血病診斷分型方面的可靠性、敏感性和特異性進行評估，其有望改變白血病的診斷和分類格局，甚至成為白血病分子分型的必備工具［9］。

綜上所述，F(xiàn)ISH、RQ-PCR或基因芯片檢測融合基因和基因重排，可用于白血病和微小殘留病(MRD)分子生物學(xué)監(jiān)測，在惡性血液病診治中發(fā)揮著越來越重要的作用，尤其對一些骨髓形態(tài)學(xué)檢查并不十分典型的白血病，通過檢出其特征性染色體的改變，可提高疾病的診斷率。白血病的分子生物學(xué)診斷既可以彌補形態(tài)學(xué)(M)、免疫學(xué)(I)和細胞遺傳學(xué)(C)檢查的不足，又能夠發(fā)現(xiàn)新的亞型。白血病相關(guān)基因的分子生物學(xué)檢測不僅診斷達到分子水平，而且可以了解患者的白血病細胞負荷情況，并及時制訂合適的治療方案，極具臨床應(yīng)用價值。

［1］府偉靈.基因診斷治療與預(yù)測醫(yī)學(xué)［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，31(1):24-25.

［2］Zechi-Ceide RM，Jesus-Oliveira NA，Guion-Almeida ML，et al.Clinical evaluation and COL2A1 gene analysis in 21 Brazilian families with Stickler syndrome:identification of novel mutations，further genotype/phenotype correlation，and its implications for the diagnosis［J］.Eur J Med Genet，2008，51(3):183-196.

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［6］杜慶鋒，劉曉力，宋蘭林，等.雙色雙融合間期熒光原位雜交探針檢測慢性髓系白血病的微小殘留病狀態(tài)［J］.中華內(nèi)科雜志，2002，41(12):801-804.

［7］姜艷梅，袁宏，劉新光，等.應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測急性髓系白血病患者AML1/ETO融合基因的臨床意義分析［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17(1):17-22.

［8］Uckun MF，Herman-Hattenk K，Crotty LM，et al.Clinical significance of mll-afl fusion transcript expression in the sbsence of a cytogenetically detectable t(4，11)(q21，q23)chromosomal translocation［J］.Blood，1998，92(3):810-821.

［9］Haferlach T，Kohlmann A，Bacher U，et al.Gene expression profiling for the diagnosis of acute leukemia［J］.Br J Cancer，2007，96(4):535-540.