食管鱗癌患者外周血Th17細(xì)胞的檢測及意義

胡 琴，陳德玉

(1江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院)

Th17細(xì)胞以表達(dá)IL-17而得名，是不同于Th1、Th2細(xì)胞的C D4+T細(xì)胞的新亞群，已經(jīng)被證實(shí)參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的發(fā)生、發(fā)展［1～3］。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在炎癥相關(guān)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，多種腫瘤患者機(jī)體內(nèi)外周血及(或)腫瘤局部存在Th17細(xì)胞比例增高。本研究檢測食管鱗癌患者外周血Th17細(xì)胞的比例變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年4月18日～2010年7月31日江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科33例食管鱗癌患者的外周血標(biāo)本，其中男20例、女13例，年齡46～73歲、平均60.3歲。腫瘤位于食管上段者7例，中段者15例，下段者11例;腫瘤直徑＞3cm者21例，≤3cm者12例;高、中分化23例，低分化及以下10例;TNM分期(2009 UICC)Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例。上述患者均有明確的病理診斷，且之前未接受過放、化療等抗腫瘤治療，均無傳染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治療史，且近期無感染性疾病等。18例健康志愿者外周血標(biāo)本由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心提供，其中男11例、女7例，年齡45～70歲、平均58.9歲，均無傳染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治療史，且近期無感染性疾病史等。本實(shí)驗(yàn)分3組:健康對(duì)照組及食管鱗癌(Ⅰ+Ⅱ)和(Ⅲ+Ⅳ)組。

1.2 主要試劑與儀器 熒光抗體鼠抗人CD4-APC、IL-17-PE購自eBioscience公司;佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)購自BD公司;莫能霉素購自Enzo公司;固定與透膜試劑盒(FIX/PERM)購自CALTAG公司;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自天津?yàn)笤噭S;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購自 Gibco公司;FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀為BD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 在無菌條件下以EDTA抗凝管抽取研究對(duì)象外周靜脈血6 ml。Ficoll密度梯度離心法常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。以含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。加入刺激劑 PMA(50 ng/ml)、Ion(1 μg/ml)及阻斷劑莫能霉素(2 μl)，予37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h。取細(xì)胞懸液 100 μl，加入 10 μl APC 標(biāo)記的抗人CD4抗體，孵育30min后洗滌3次。加入100 μl固定劑A，反應(yīng)15min后洗滌1次，再加入100 μl透膜劑B，反應(yīng)5min后加入10 μl PE標(biāo)記的抗人IL-17抗體，孵育30min后洗滌3次，以300 μl冷 PBS重懸細(xì)胞。24 h內(nèi)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析。流式細(xì)胞儀檢測以CD4設(shè)門，分析門內(nèi)CD4+IL-17+細(xì)胞亞群，用 Cellquest軟件分析 CD4+IL-17+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 食管鱗癌患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為(6.3±3.5)%，顯著高于健康對(duì)照組(1.8±1.2)%(P＜0.01)。食管鱗癌(Ⅰ+Ⅱ)期組外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為(3.4±1.1)%，較健康對(duì)照組上調(diào)(P＜0.05);食管鱗癌(Ⅲ+Ⅳ)期組為(8.4±3.9)%，顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.01);食管鱗癌(Ⅲ+Ⅳ)期組Th17細(xì)胞比例顯著高于(Ⅰ+Ⅱ)期組(P＜0.01)。

2.2 Th17細(xì)胞比例與臨床病理特征的關(guān)系 Th17細(xì)胞比例與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度無明顯相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P均＜0.01)。

3 討論

我國處于世界食管癌相對(duì)高發(fā)地帶，其發(fā)病和死亡平均水平列惡性腫瘤前列［4］。越來越多的證據(jù)表明，包括食管鱗癌在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都與炎癥聯(lián)系密切。IL-17作為Th17細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的促炎癥作用。Zhang等［5］發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血Th17細(xì)胞比例較健康對(duì)照組增高，且Th17細(xì)胞比例增高的程度與胃癌的臨床分期有關(guān)，認(rèn)為Th17細(xì)胞可能促進(jìn)胃癌的病理進(jìn)展。Le Gouvello等［7］發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者腫瘤組織內(nèi)Th17細(xì)胞的比例明顯高于自身正常結(jié)腸內(nèi)的Th17水平。與結(jié)腸癌中的發(fā)現(xiàn)相似，Zhang等［8］研究證實(shí)，肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織與非腫瘤組織相比，Th17細(xì)胞水平也升高。另有Sfanos等［9］報(bào)道Th17細(xì)胞參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占CD+4T細(xì)胞的比例顯著高于健康對(duì)照組，因此，我們推測Th17細(xì)胞在食管鱗癌的發(fā)展過程中可能起著重要作用。同時(shí)，結(jié)合患者的臨床及病理資料，我們發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者外周血中Th17細(xì)胞的比例與患者的年齡、性別及腫瘤的位置、大小、浸潤深度、分化程度無明顯相關(guān)性，而與腫瘤的TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。此結(jié)果提示我們，食管鱗癌患者外周血中Th17細(xì)胞的比例顯著增高是食管鱗癌的后期事件，在腫瘤發(fā)生的早期，癌腫對(duì)全身免疫系統(tǒng)的影響不明顯，而隨著癌腫的不斷進(jìn)展，可影響到全身，使Th17細(xì)胞不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致患者外周血中Th17細(xì)胞比例進(jìn)一步增高。因而，我們認(rèn)為Th17細(xì)胞參與了食管鱗癌的病理進(jìn)展，檢測其水平對(duì)于判斷病期及預(yù)后有一定價(jià)值。

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