血清抗碳酸酐酶Ⅲ抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

碳酸酐酶(CA)是一組含鋅的金屬酶，廣泛參與機(jī)體的多種生理過(guò)程［1，2］。研究表明，抗CAⅡ和抗CAⅣ抗體參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性胰腺炎、硬皮病、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的發(fā)生發(fā)展［3～6］。但國(guó)內(nèi)尚無(wú)自身免疫疾病患者和健康人群的血清CAⅢ抗體水平的報(bào)道。2009年5月～2010年2月進(jìn)行本研究，著眼于建立適用于臨床的抗CAⅢ抗體的ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)健康人群和自身免疫疾病患者抗CAⅢ抗體水平進(jìn)行初步調(diào)查。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者40例，男7例、女33例，年齡20～35歲、平均29歲;皮肌炎患者9例，男3例、女6例，年齡25～35歲、平均31歲;高血壓腎病患者30例，男女各半，年齡65～75歲、平均70歲;2型糖尿病腎病患者30例，男18例、女12例，年齡65～75歲、平均68歲;選取性別、年齡匹配無(wú)上述疾病的健康人為對(duì)照。所有受試者均知情同意。按照已建立的方法分別使用小牛血清和健康人血清為陰性對(duì)照，對(duì)上述人群血清的抗CAⅢ抗體水平進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)健康對(duì)照測(cè)定均值+2SD 確定 cutoff值［6］。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 酶標(biāo)板，Costar;洗板機(jī)，雷杜RT-3000;酶標(biāo)儀，雷杜RT-6000。重組人CAⅢ(33.9 kDa，貨號(hào):ab82823)，abcam公司;小鼠抗人 CAⅢ單克隆抗體(貨號(hào):ab54913)，abcam公司;抗CAⅣ抗體(貨號(hào):sc-25598)，Santa Cruz公司;HRP標(biāo)記的二抗、四甲基聯(lián)苯胺，KPL公司;Tween-20、小牛血清、H2O2，上海生工;其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELISA操作步驟 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用包被緩沖液稀釋CAⅢ至5 μg/ml;包被的酶標(biāo)板用保鮮膜封好，置4℃過(guò)夜;使用洗滌液緩沖液清洗5次，每孔加入封阻緩沖液，于室溫下放置30 min，用洗滌液洗板5次;每孔加入100 μl經(jīng)1∶50稀釋后的血清樣品及陰性對(duì)照，室溫(20℃)放置1 h，洗滌緩沖液洗板5次;每孔加入封閉緩沖液稀釋的二抗100 μl，室溫放置 1 h;每孔中加入 100 μl底物緩沖溶液，室溫避光反應(yīng)30 min;每孔加入25 μl終止液，讀取450 nm處(參考波長(zhǎng)630 nm)OD值。

1.3.2 抗體工作濃度的確定 抗原包被濃度為5 μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品按照 1∶1 000～1∶32 000 倍比稀釋?zhuān)诿總€(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品倍比稀釋孔中分別使用不同稀釋倍數(shù)(1∶500～1∶8 000)的酶標(biāo)二抗，其他實(shí)驗(yàn)條件一致，比較各孔450 nm處(參考波長(zhǎng)630 nm)OD值，確定酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)，最后建立標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.3.3 方法學(xué)考證 精密度:取高(OD=3.0)、中(OD=1.2)、低(OD=0.5)3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品同批測(cè)定20次，計(jì)算批內(nèi)精密度;每份樣品每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)20 d，計(jì)算批間精密度。穩(wěn)定性［7］:①試劑穩(wěn)定性:新鮮配制的試劑置4℃冰箱，分別于第2、4、8、15和30天測(cè)定同一中值標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算變異系數(shù);②標(biāo)本穩(wěn)定性:3份OD中值患者血清分裝為2組，第1組保存于室溫(約20℃)，并于第2、6、12小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，第2組保存于4℃，于第6、12、24 小時(shí)進(jìn)行測(cè)定。靈敏度［8］:使用公式OD靈敏度=OD零劑量+t0.95×SD/n 計(jì)算 95%可信區(qū)間下的靈敏度(n=20)。回收實(shí)驗(yàn):測(cè)定中值抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)品，后于該標(biāo)準(zhǔn)品中加入高濃度抗CAⅢ抗體溶液，使其終濃度計(jì)算值為中值標(biāo)準(zhǔn)品的110%，根據(jù)前后測(cè)定結(jié)果計(jì)算回收率。干擾實(shí)驗(yàn):標(biāo)本性狀的干擾:分別使用正常、乳糜、黃疸及溶血的血清標(biāo)本(排除自身免疫性疾病)稀釋抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)品，使用已建立的方法分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè);CA同工酶的干擾:分別對(duì)抗CAⅣ抗體(1∶100稀釋)及抗CAⅣ抗體中值標(biāo)準(zhǔn)品與抗CAⅢ抗體(最終稀釋倍數(shù)為1∶100)的混合物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的建立 方陣滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OD值在酶標(biāo)二抗稀釋倍率為1∶2 000～1∶4 000時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯變化，考慮其OD值應(yīng)大小適中，選擇酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1∶2 000。在上述反應(yīng)條件下，以抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋倍數(shù)(T)的自然對(duì)數(shù)(logeT)為橫軸，以O(shè)D值A(chǔ)為縱軸，使用SPSS11.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示logeT與其OD值之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2=0.95，標(biāo)準(zhǔn)方程為:Y= －0.13logeT+1.59。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià) 3個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)精密度為 5.6%～6.7%、平均 6.2%，批間精密度為 7.5%～8.8%、平均 8.2%。靈敏度為 0.025。試劑穩(wěn)定性和標(biāo)本穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果之間的變異程度均低于10%。經(jīng)測(cè)定并計(jì)算，回收率為106%。血紅蛋白濃度為12 g/L的溶血標(biāo)本、甘油三酯為23.5 mmol/L的乳糜標(biāo)本、膽紅素為571 μmol/L的黃疸標(biāo)本及抗CAⅣ抗體均不能對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成顯著影響。

2.3 臨床樣本檢測(cè)應(yīng)用 分別使用小牛血清和健康人血清作陰性對(duì)照，前者的測(cè)定結(jié)果略低但不存在顯著性差異，為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，對(duì)患者標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定時(shí)均使用健康人血清為陰性對(duì)照。糖尿病腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.33±0.06)高于健康對(duì)照組(0.03 ±0.02)(P ＜0.05);高血壓腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.04±0.02)略高于健康對(duì)照組(0.03±0.02)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組的血清抗CAⅢ抗體水平(1.12 ±0.19)高于健康對(duì)照組(0.04 ±0.01)(P＜0.05)。抗CAⅢ抗體陽(yáng)性率在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者為43%，糖尿病腎病患者為18%，皮肌炎、高血壓腎病患者和健康對(duì)照未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

3 討論

自身抗體的檢測(cè)在很多疾病尤其是自身免疫性疾病的診治中的重要性日益凸顯，CAⅢ抗體作為自身抗體的一種已經(jīng)引起了很多科研工作者的重視［2］。但對(duì)其進(jìn)行的研究大多還基于免疫印記、原位雜交等［3，9］，這些方法雖然靈敏可靠但操作復(fù)雜，成本偏高，不能廣泛應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)并沒(méi)有對(duì)CAⅢ抗體檢測(cè)的試劑盒，本研究成功建立了人血清CAⅢ抗體的ELISA檢測(cè)方法，其精密度、穩(wěn)定性、抗干擾能力等技術(shù)指標(biāo)均能滿(mǎn)足ELISA常規(guī)檢測(cè)的要求，且操作方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，所用試劑市場(chǎng)均有銷(xiāo)售，檢測(cè)成本與常規(guī)ELISA檢測(cè)類(lèi)似，可上機(jī)進(jìn)行大批量分析，具備進(jìn)入臨床應(yīng)用的潛質(zhì)。

已有研究表明，抗CAⅢ抗體可出現(xiàn)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者［9］，抗CAⅠ、CAⅡ和CAⅣ抗體可出現(xiàn)于自身免疫性胰腺炎患者［6］;人體內(nèi)CAⅡ抗體與CAⅡ的結(jié)合可使CA發(fā)生空間構(gòu)象改變并影響酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶活性降低30%以上［5］，而抑制CA的功能可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂和功能障礙，甚至引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒［10］。人體內(nèi)如果累積過(guò)多的抗CAⅢ抗體必然會(huì)與CAⅢ發(fā)生免疫反應(yīng)，干擾CA的正常功能，進(jìn)而可能對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生不利影響。

本研究結(jié)果提示，抗CAⅢ抗體可出現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和2型糖尿病腎病患者。由于細(xì)胞和體液免疫功能障礙，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，約50%患者有腎臟疾病臨床表現(xiàn)，大部分患者在某一階段發(fā)生一項(xiàng)或幾項(xiàng)血液系統(tǒng)異常，CAⅢ在腎臟和紅細(xì)胞中的含量較豐富，其自身抗體很有可能參與了本病的發(fā)生發(fā)展［11］。皮肌炎的主要特點(diǎn)是肌肉和皮膚受累，較少累及CAⅢ含量較豐富的血液系統(tǒng)和腎臟，這可能是皮肌炎患者血清抗CAⅢ抗體與健康對(duì)照無(wú)顯著性差異的原因。2型糖尿病腎病是2型糖尿病的重要慢性并發(fā)癥之一，自身免疫在2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球、腎小管聚集導(dǎo)致的腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化是其特征性病理改變。研究表明［5］，當(dāng)免疫復(fù)合物在腎單位沉積時(shí)，能刺激浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞及腎小球細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，包括補(bǔ)體、生長(zhǎng)因子、血管活性物質(zhì)、細(xì)胞活素類(lèi)物質(zhì)等，從而促進(jìn)2型糖尿病腎病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病腎病患者血清中抗CAⅢ抗體濃度與健康對(duì)照組相比有顯著差異，且與國(guó)外使用免疫印記方法進(jìn)行的測(cè)定具有相同的變化趨勢(shì)［12］，提示抗CAⅢ抗體可能參與了本病的發(fā)生發(fā)展。高血壓腎病患者血清的抗CAⅢ抗體水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，這一結(jié)果從側(cè)面印證了糖尿病腎病具備自身免疫性疾病的特點(diǎn)，因此使用本法對(duì)同時(shí)患有糖尿病和高血壓的患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)可能對(duì)確定其腎臟損傷的病因提供幫助。在健康對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中，年齡較高受試者的抗CAⅢ抗體水平略高于低齡受試者，但不存在顯著性差異，這種現(xiàn)象可能是增齡性的自身抗體水平升高所致。

目前國(guó)內(nèi)外已有越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注CA自身抗體的研究，并在多種疾病中發(fā)現(xiàn)其自身抗體，但這些研究大都處于臨床觀察階段，各型CA同工酶自身抗體的疾病特異性、對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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