惡性腦膠質(zhì)瘤U87細胞系腫瘤干細胞放療敏感性的體外實驗研究

趙紅宇，徐 東，李 帥，王 倩，劉海君，金 輝，劉云會*

(1中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院，沈陽110004;2中國醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系;3中國醫(yī)科大學臨床藥理實驗室)

惡性腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其惡性程度極高，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%以上;臨床上患者雖經(jīng)放療、化療及手術等干預治療，但其病死率仍居高不下，中位生存期僅14.6個月［1］。近年研究表明，腦膠質(zhì)瘤內(nèi)存在小的細胞亞群——腫瘤干細胞(CSCs)，其具有神經(jīng)干細胞(NSCs)特性，能進行自我更新、多向分化及體內(nèi)致瘤，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根源［2］。在腦膠質(zhì)瘤 CSCs成功分離與鑒定的基礎上，不斷有學者提出CSCs的治療策略［3］。2007～2008年，我們在成功分離、鑒定 U87惡性腦膠質(zhì)瘤CSCs的基礎上，檢測了腦膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞及其CSCs的體外放療敏感性，旨在探討CSCs在惡性腦膠質(zhì)瘤放療抵抗性中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 腦膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞(中國科學院)，DMEM/F12培養(yǎng)液(Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)。NSCs標記物鑒定試劑盒，NSCs表面標記物小鼠抗人CD133單抗、小鼠抗人Nestin單抗、小鼠抗人微管相關蛋白2(MAP2)單抗、兔抗人膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)多抗、小鼠抗人O1單抗，Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87細胞培養(yǎng)和傳代 將U87細胞接種于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后，按1∶2或1∶3比例傳代。

1.2.2 CSCs培養(yǎng)和傳代 將U87細胞接種于含B27、肝素、表皮生長因子、堿性成纖維生長因子的無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待U87細胞增殖形成細胞球3～4 d后，吸取上清培養(yǎng)液 (含細胞球)，重新吹打成單細胞懸液，按1∶2或1∶3比例傳代。

1.2.3 CSCs鑒定 原代細胞球形成并達到100～200個細胞后，收集其細胞球，用0.1%胰蛋白酶和1×EDTA在37℃下處理10 min，細胞球分解成單細胞后，轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)皿進行培養(yǎng);稀釋細胞懸液為1～2個細胞/孔，觀察單細胞克隆能力。將細胞離心后種植于盒式載玻片中，以2%多聚甲醛固定，室溫15 min;10%驢血清封閉，室溫1 h。以NSCs標記物鑒定試劑盒進行細胞染色，室溫孵育2 h;加入Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。在顯微鏡下隨機選擇20個高倍視野進行陽性CSCs計數(shù)。

1.2.4 實驗分組及照射干預 將傳代的U87細胞及CSCs均以隨機數(shù)字法設立對照組與照射組，對照組不進行照射;照射組分為 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy 劑量組，均在室溫下用西門子Primus-M型直線加速器進行照射。

1.2.5 集落形成實驗 分別收集兩種細胞制成懸液，加入24孔培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿接種400個細胞。對照組及照射組細胞均在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用95%乙醇固定、0.25%結(jié)晶紫染色，并計數(shù)≥50個細胞的集落，計算集落形成率及細胞存活分數(shù)(SF，SF=照射組集落形成率/對照組集落形成率)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間率的比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 U87細胞生長及CSCs形成、增殖 在FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，U87細胞呈貼壁生長并交織成網(wǎng)狀;轉(zhuǎn)移到無FBS的NSCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d后，少部分細胞自我增殖呈球狀或卵球狀懸浮的細胞球克隆，每細胞球有100～200個細胞。初代細胞球細胞分解成單細胞后，重新在NSCs培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其細胞均能形成2代細胞球。

2.2 CSCs鑒定 細胞球細胞表達NSCs的表面標記物 CD133、Nestin，而不表達星形細胞標記物GFAP和神經(jīng)元標記物MAP2，極少表達少突膠質(zhì)細胞標記物O1。多數(shù)分化細胞表達GFAP，少數(shù)表達MAP2和 O1。

2.3 X線照射對U87細胞及CSCs的影響 照射組照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy劑量時，U87細胞及CSCs的存活率分別由1%逐漸降至0、0.2%。隨著照射劑量增加，U87細胞及CSCs的存活率均下降(P＜0.01)，且CSCs的存活率高于U87細胞(P＜0.01)。

3 討論

近年研究表明［4，5］，惡性腦膠質(zhì)瘤內(nèi)具有 NSCs特性的細胞亞群CSCs，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了決定性作用。這些細胞在體外可形成克隆球，具有多向分化及體內(nèi)致瘤能力。本研究結(jié)果顯示，惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞及CSCs接受X線照射后，其細胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加而細胞存活率逐漸下降;并發(fā)現(xiàn)在同一劑量放射線干預下，U87細胞的存活率明顯低于CSCs。表明U87細胞系CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，CSCs具有明顯的放療抵抗性。

目前，應用傳統(tǒng)的抗腫瘤放療手段雖能抑制腫瘤細胞增殖，但其作用短暫，且腫瘤容易復發(fā)。近年研究認為，因CSCs較其他分化的腫瘤細胞具有更強的放療抵抗性，故放射線干預僅能殺滅或抑制腫瘤中的非腫瘤干細胞，而對其CSCs則較少或無治療作用［6］。本研究結(jié)果證實了這一現(xiàn)象。

放射生物學理論認為，DNA作為放射線對細胞作用的關鍵靶點，在放療機制中發(fā)揮重要的作用;DNA損傷程度反映放療敏感性的強弱，DNA損傷后迅速修復是放療抵抗性的關鍵原因［7］。Bao等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在放射劑量干預下，CSCs的存活比例明顯高于腫瘤細胞;并發(fā)現(xiàn)CSCs的放療抵抗性增高是通過首先激活檢查點蛋白實現(xiàn)的，應用檢查點激酶的特異性抑制劑能抑制CSCs的DNA損傷修復，逆轉(zhuǎn)CSCs的放療抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能與影響細胞周期調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導通路改變有密切關系。

綜上所述，根據(jù)CSCs的放療抵抗特性，尋找特異性針對CSCs的治療手段，可能從根本上遏制腫瘤生長;探索針對CSCs的放射增敏，將成為腫瘤放療極具前途的發(fā)展方向。

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