22R序列l(wèi)oop和泡突變對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的作用

王紅鋼，王予東

（1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 開(kāi)封 475004；2.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，河南 開(kāi)封 475004）

22R序列l(wèi)oop和泡突變對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的作用

王紅鋼1，王予東2

（1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 開(kāi)封 475004；2.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，河南 開(kāi)封 475004）

目的:我們研究室的前期工作在猴空泡病毒40（SV40）早期mRNA PolyA序列（SV40PolyA）中發(fā)現(xiàn)1個(gè)活化基因的原件22R（5′－GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT－3′），該片段可以解除 Alu串連序列（或 Line－1重復(fù)序列）對(duì)GFP報(bào)告基因的抑制作用。我們研究22R突變對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的作用。方法：將22R及其突變片段插入pEGFP－C1質(zhì)粒，構(gòu)建表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：AAG、AGA、TGT、TTG和 TGC（22R，野生型）5個(gè)質(zhì)粒促進(jìn)基因表達(dá)作用比較明顯。VECT、VEGT、VETA、VETC、VETG和VETT明顯促進(jìn)GFP基因表達(dá)。結(jié)論：22Rloop和泡的突變對(duì)其活化GFP報(bào)告基因作用有重要影響。

SV40PolyA；22R；GFP；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)染

非編碼序列在真核生物基因組中廣泛存在，而且在進(jìn)化上有強(qiáng)制性，所有的真核生物物種及其中的每一個(gè)個(gè)體都有大量的非編碼序列。遺傳學(xué)有一個(gè)著名的命題，即凡是有利的基因被強(qiáng)制保留，凡是有害的基因被強(qiáng)制剔除，凡是無(wú)害也無(wú)利的基因出現(xiàn)多態(tài)性。非編碼序列在基因組中強(qiáng)制存在，一定有其重要的生物學(xué)功能［1－4］。盡管已經(jīng)深入研究了非編碼序列的功能，但其中大部分序列的功能還不清楚［5］。莖環(huán)結(jié)構(gòu)一般都具有保守性，參與多種生物學(xué)過(guò)程，比如病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄終止和 mRNA 成熟［6－10］。

我們課題組以前的研究表明，在pEGFP－C1質(zhì)粒的GFP基因下游插進(jìn)含有14個(gè)Alu同向重復(fù)的片段（Alu14），GFP基因表達(dá)明顯受到抑制［11］。再將SV40PolyA正反序列插到GFP和Alu14間，結(jié)果GFP基因表達(dá)明顯增強(qiáng)［12］。SV40PolyA序列中哪個(gè)片段能夠促進(jìn)GFP基因表達(dá)？將SV40PolyA分成4段，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，第二段2F2R（60bp）有基因活化 作 用，2F2R 中 的 22bp 片 段 （5′－GTG AAAAAAATGCTTTATTTGT）也能活化基因。

1 材料和方法

1.1 材料

pAlu14質(zhì)粒為本研究室前期工作構(gòu)建，系將14個(gè)Alu元件同向、正向串連插入pEGFP－C1質(zhì)粒的GFP基因下游。pEGFP－C1質(zhì)粒為空載體，不含有插入序列。pEGFP－C1質(zhì)粒、DH5α菌株和HeLa細(xì)胞均為我們實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 22R序列莖環(huán)結(jié)構(gòu) 用軟件分析22R序列，該序列可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)loop（TGC）、2個(gè)莖（AAA／TTT）和1個(gè)泡（A／A），見(jiàn)圖1。文中將loop堿基突變和泡堿基突變的22R插入pEGFP－C1－Alu14質(zhì)粒，對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響。

圖1 22R經(jīng)軟件分析的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 合成帶有22R突變位點(diǎn)的模板序列，見(jiàn)表1、表2。用帶有酶切位點(diǎn)引物PCR擴(kuò)增合成的模板，引入酶切位點(diǎn)。將突變序列插入pEGFP－C1質(zhì)粒，利用XbaⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)可使T4DNA連接酶連接但是連接以后對(duì)2種酶均不敏感的特性，制成帶有22R突變序列的2串聯(lián)質(zhì)粒，將突變的插入序列切下連入C1－Alu14質(zhì)粒（pEGFP－C1－Alu14）的 GFP基因和 Alu串聯(lián)序列之間，測(cè)序正確后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活新生小牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，培養(yǎng)瓶溫箱培養(yǎng)3d，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用質(zhì)粒（包括重組表達(dá)載體和pEGFP－C1）0.4μg和 Lipofectamine TM 2000（Invitrogen Carlsbad，USA）2μL瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24孔板的HeLa細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)36h，用于熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 熒光細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36h后取出，甩干培養(yǎng)基，每孔加入0.5mL體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛PBS固定，固定20min后用PBS洗2遍。在100倍視野白光下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，同樣視野紫蘭光下計(jì)數(shù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)至少500個(gè)，按以下公式計(jì)算熒光細(xì)胞陽(yáng)性率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 22R序列l(wèi)oop突變對(duì)GFP報(bào)告基因的表達(dá)作用

將HeLa細(xì)胞用胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基配成2×105／mL加入24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5mL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)24h，用構(gòu)建的插入loop突變序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染量均為0.4μg質(zhì)粒／2μL脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)36h，固定細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，結(jié)果見(jiàn)表3。loop的堿基類型顯著影響GFP基因表達(dá)，AAG、AGA、TGT、TTG和 TGC（22R，野生型）5個(gè)質(zhì)粒促進(jìn)基因表達(dá)作用比較明顯（表3中字體斜體加粗標(biāo)出）。AAA質(zhì)?；罨虻淖饔米钊?。

2.2 22R序列泡突變對(duì)GFP報(bào)告基因的表達(dá)作用

HeLa細(xì)胞用胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基配成2×105／mL加入24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5mL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)24h，用構(gòu)建的插入泡突變序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染量均為0.4μg質(zhì)粒／2μL脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)36h，固定細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，結(jié)果見(jiàn)表4。泡的堿基類型顯著影響GFP基因表達(dá)，有2個(gè)質(zhì)粒，即VECT、VEGT，促進(jìn)基因表達(dá)與22R（VEAA，野生型）類似，其熒光陽(yáng)性率分別為2.70%和1.73%，連同22R用空心字體標(biāo)出（表4）。VETA、VETC、VETG和VETT 4個(gè)質(zhì)粒更加明顯地促進(jìn)GFP基因表達(dá)，熒光陽(yáng)性率分別為5.60%、2.96%、12.76%和20.34%，在表4中，字體斜體加粗標(biāo)出。這幾個(gè)插入序列具有高度活化GFP基因作用的質(zhì)粒，有1個(gè)共同的特點(diǎn)，即均含有“AAATAAA”片段，這段序列在活化基因中是否有重要作用，又構(gòu)建AA、TT、7pieA 和7pieT序列，插入 C1－Alu14質(zhì)粒的GFP基因和Alu串連序列之間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA序列（GTGAAATAAATGCAAATAAAGT）明顯活化基因（表4，序列號(hào)17），TT、7pieA和7pieT插入序列活化基因作用較弱或不能活化GFP基因。

表1 構(gòu)建22R環(huán)的突變表達(dá)載體的引物或模板

表2 構(gòu)建22R泡的突變表達(dá)載體的引物或模板

表3 22R環(huán)的突變對(duì)GFP基因表達(dá)的影響

表4 22R泡的突變對(duì)GFP基因表達(dá)的影響

3 討論

我們查閱到的有關(guān)莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)生物學(xué)功能影響的文獻(xiàn)，其中多數(shù)使用病毒作為研究實(shí)體。噬菌體N4啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)5～7bp長(zhǎng)的反向重復(fù)序列，反向重復(fù)序列間隔3個(gè)堿基（形成環(huán)），這樣的序列可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是噬菌體生存所必需的［13－14］。

我們觀察到22R序列的loop堿基突變中，AAG、AGA、TTG和TGT活化基因作用最強(qiáng)，這4個(gè)序列以AG或TG為主，其中AAG與TTG類似，AGA與TGT類似，這樣的序列和結(jié)構(gòu)是否有助于活化基因，有待于進(jìn)一步研究。

我們也查閱到了泡的改變，影響病毒復(fù)制工作。有專家［15］報(bào)道，病毒的第35個(gè)堿基 A（A35）與其他堿基不互補(bǔ)，可形成該區(qū)域莖環(huán)結(jié)構(gòu)的泡，如果刪除A35，它所在區(qū)域的序列就完全互補(bǔ)，病毒就無(wú)法復(fù)制［15］。文中對(duì)22R的泡部位全部可能的突變42＝16種排列組合，均作了觀察，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)質(zhì)粒，即VECT、VEGT，促進(jìn)基因表達(dá)與22R（VEAA，野生型）類似，其熒光陽(yáng)性率分別為2.70%和1.73%（表4），這2個(gè)質(zhì)粒均有 TTTTTTT片段。有TTTTTTT片段的質(zhì)粒共有4個(gè)，即VEAT、VECT、VEGT及VETT，其中除了VEAT（過(guò)度互補(bǔ)）以外均可以活化基因。重要的是發(fā)現(xiàn)了，VETA、VETC、VETG和VETT插入片段的4個(gè)質(zhì)粒更加明顯地促進(jìn)GFP基因表達(dá)，熒光陽(yáng)性率分別為5.60、2.96、12.76和20.34（表4）。這幾個(gè)具有高度活化GFP基因作用的質(zhì)粒有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即均含有“AAATAAA”序列片段，這段序列在活化基因中是否有重要作用，又構(gòu)建AA、TT、7pieA及7pieT序列，插入C1－Alu14質(zhì)粒的GFP基因和Alu串連序列之間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA序列（GTGAAATAAATGCA AATAAAGT）明顯地活化基因（表4，序列號(hào)17），但是活化基因作用低于VETT序列（GTGAAATAA ATGCTTTTTTTGT，4TMI），看來(lái)AAA TAAA 需要和其他序列搭配才可以發(fā)揮最好的活化基因作用。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)和泡的突變均影響其生物學(xué)功能，只有適當(dāng)?shù)那o環(huán)結(jié)構(gòu)才能活化基因。

［1］Hüttenhofer A，Vogel J.Experimental approaches to identify non－coding RNAs［J］.Nucleic Acids Res，2006，34（2）：635－646.

［2］Morey C，Avner P.Employment opportunities for noncoding RNAs［J］.FEBS Lett，2004，567（1）：27－34.

［3］Mallory A C，Vaucheret H.MicroRNAs：something important between the genes［J］.Curr Opin Plant Biol，2004，7（2）：120－125.

［4］Fedorova L，F(xiàn)edorov A.Introns in gene evolution［J］.Genetica，2003，118（2／3）：123－31.

［5］Shabalina S A，Spiridonov N A.The mammalian transcriptome and the function of non－coding DNA sequences［J］.Genome Biol，2004，5（4）：105.

［6］Lommel S A，Weston－Fina M，Xiong Z，et al.The nucleotide sequence and gene organization of red clover necrotic mosaic virus RNA－2［J］.Nucleic Acids Res，1988，16（17）：8587－8602.

［7］Iwakawa H O，Kaido M，Mise K，et al.Cis－acting core RNA elements required for negative－strand RNA synthesis and cap－independent translation are separated in the 3′－untranslated region of Red clover necrotic mosaic virus RNA1［J］.Virology，2007，369（1）：168－181.

［8］Frolov I，Hardy R，Rice C M.Cis－acting RNA elements at the 5′end of Sindbis virus genome RNA regulateminus－and plus－strand RNA synthesis［J］.RNA，2001，7（11）：1638－1651.

［9］Zuker M.Mfold server for nucleic acid folding and hybridization prediction［J］.Nucleic Acids Res，2003，31（13）：3406－3415.

［10］Rosskopf J J，Upton J H 3rd，Rodarte L，et al.A 3′terminal stem－loop structure in Nodamura virus RNA2 forms an essential cis－acting signal for RNA replication［J］.Virus Res，2010，150（1／2）：12－21.

［11］Wang X F，Wang X Y，Liu J，et al.Alu tandem sequences inhibit GFP gene expression by triggering chromatin wrapping［J］.Gene ＆ Genomics，2009，31（3）：209－215.

［12］Yin K，Wang X，Ma H，et al.Impact of copy number of distinct SV40PolyA segments on expression of GFP report gene［J］.Sci China Life Sci，2010，53（5）：606－612.

［13］Gleghorn M L，Davydova E K，Rothman－Denes L B，et al.Structural basis for DNA－h(huán)airpin promoter recognition by the bacteriophage N4virion RNA polymerase［J］.Mol Cell，2008，32（5）：707－717.

［14］Dai X，Kloster M，Rothman－Denes L B.Sequence－dependent extrusion of a small DNA hairpin at the N4virion RNA polymerase promoters［J］.Jmol Biol，1998，283（1）：43－58.

［15］Li L，Kang H，Liu P，et al.Structural lability in stemloop 1drives a 5′UTR－3′UTR interaction in coronavirus replication［J］.Jmol Biol，2008，377（3）：790－803.

［責(zé)任編輯 時(shí) 紅］

Effect of 22R loop and vesical base mutation on GFP gene expression

WANG Hong－gang1，WANG Yu－dong2（1.Department of Biochemistry and molecular Biology，Medical College，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Department of Preventive Medicine，Medical College，Henan University，Kaifeng Henan 475004，China）

Objective：Our work previously reported one activating gene sequences in early mRNA SV40PolyA，namely 22R（5′－GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT－3′）which can relieve the inhibition of GFP gene induced by Alu tandem sequences.In this study，we mutated 22Rto study the role of DNA structure in its activating GFP gene expression.Methods：The 22Rand its mutated fragments were inserted into downstream of GFP gene in pAlu14to construct expression vector，transfected with HeLa cells and the expression of green fluorescence protein was observed.Results：The changing loop of 22R，AAG、AGA、TGT、TTG and TGC（22R，wild type）had the effects on significantly activating GFP gene expression （marked in black bold）；changing vesical，VECT，VEGT，VETA，VETC，VETG and VETT could obviously activate GFP gene expression.Conclusion：The loop and vesical of 22R are important for 22Ractivating GFP gene.

SV40PolyA；22R；GFP；Stem－loop structure；Transfection

Q786

A

1672－7606（2011）04－0255－05

2011－09－30

王紅鋼（1975－），男，河南 開(kāi)封 人，博士，副教授，從事基因表達(dá)調(diào)節(jié)的研究工作。