草坪草抗銹病遺傳育種研究進(jìn)展

張露明，張學(xué)勇，王兆明，邵新慶，王赟文

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京 100193； 2.遼寧大學(xué)生態(tài)環(huán)境研究所，遼寧 沈陽 110036；3.遼寧省岫巖滿族自治縣草原監(jiān)理站，遼寧 岫巖 114300)

銹病(病原菌主要為Pucciniaspp.和Uromycesspp.)是草坪草上常見的一類氣傳真菌病害，主要危害禾草的葉片和葉鞘。草坪草絕大多數(shù)為多年生植物，種類的相對單一性和大面積種植為銹病流行提供了有利的條件。草坪銹病發(fā)病初期，病部出現(xiàn)小型褪綠斑點，繼而形成黃銹色皰狀孢子堆，并散出大量黃色、橙黃色夏孢子。條件適合時，銹病蔓延迅速，發(fā)病中心擴(kuò)大，引起草坪草大片枯黃，綠期縮短，使草坪失去生機(jī)，嚴(yán)重時導(dǎo)致草坪草抗逆性降低，甚至植株死亡，顯著降低了草坪草的觀賞和使用價值[1]。近十幾年來，國內(nèi)外對草坪病害的研究不斷深入，在草坪草銹病的病原菌鑒定、流行規(guī)律及抗銹性遺傳機(jī)制方面取得了一系列成果。在草坪草銹病防治方面，通過培育和利用抗銹草坪草品種、聚集抗性基因等遺傳改良手段來提高草坪草的抗銹性能受到越來越多的重視。

1 草坪草銹病的病原菌及流行規(guī)律

1.1銹病危害及病原菌 草坪草受銹病侵害的時期較長，可以從5月一直延續(xù)到11月，主要危害草坪草的葉片和葉鞘。禾草感染銹病后葉綠素被破壞、光合作用降低，蒸騰作用增強(qiáng),大量失水至葉片變黃枯死。發(fā)病初期，葉片和莖上出現(xiàn)淺黃色褪綠斑點，隨著病害的發(fā)展，病斑數(shù)目增多，形成大量的夏孢子堆，嚴(yán)重時孢子堆匯合成條狀、線狀。孢子堆破裂后從內(nèi)散發(fā)出黃色、棕黃色的夏孢子。病害發(fā)展到后期，病部出現(xiàn)鐵銹色或黑色的冬孢子堆，遠(yuǎn)觀草坪呈枯黃色。銹病雖然不會引起草坪植物急性死亡，但卻導(dǎo)致草坪植物生長不良，抗逆性降低，散出的大量孢子易污染游人的衣物，甚至導(dǎo)致游人過敏，極大地影響草坪的利用價值[2]。據(jù)報道[3]我國有19個省市有冷季性草坪草銹病發(fā)生,主要為山東、陜西、甘肅、寧夏、河北、青海等地，成都、合肥等地偶有報道，其他省份未見報道。暖季型草坪草銹病報道發(fā)生主要集中在福建、臺灣、廣東等地，上海及南京也有報道[1]。

主要的冷季型草坪草，包括草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festucaarundinacea)、多年生黑麥草(Loliumperenne)等；暖季型草坪草，如結(jié)縷草(Zoysiaspp.)、狗牙根(Cynodondactylon)等，均易發(fā)生銹病危害。引起草坪草銹病的真菌主要包括柄銹菌屬(Puccina)、單胞銹菌屬(Uromyces)中的幾個種，以及引起地毯草(Axonopuscompressus)銹病的Physopellacompressa和引起狗牙根銹病的狗牙根夏孢銹菌(Uredo.cynodontis-dactylis)。銹菌分類主要是根據(jù)冬孢子的形態(tài)、排列和萌發(fā)的形式。如柄銹菌屬可引發(fā)草坪草的條銹病和葉銹病，它的孢子形態(tài)主要為:冬孢子有柄,雙細(xì)胞，深褐色，單主或轉(zhuǎn)主寄生。性孢子器球形，銹孢子器杯狀或筒狀，銹孢子單細(xì)胞，球形或橢圓形；夏孢子黃褐色，單細(xì)胞，近球形，壁上有微刺[4]。銹菌是專性寄生菌，不同地區(qū)及不同寄主的銹病病原物的種類不同。銹菌群體內(nèi)根據(jù)對不同品種的致病力，存在著生理小種的分化。從銹病發(fā)生部位區(qū)分，草坪草銹病主要有葉銹、稈銹、冠銹等3種。例如，早熟禾、黑麥草、羊茅葉銹病的病原菌為短柄草柄銹菌(P.brachypod)，早熟禾、黑麥草稈銹病由禾柄銹菌(P.graminis)引起，而早熟禾、黑麥草和高羊茅冠銹病的病原菌則為冠柄銹菌(P.coronata)；狗牙根銹病由狗牙根柄銹菌(P.cynodontis)或狗牙根夏孢銹菌引起，結(jié)縷草銹病則由結(jié)縷草柄銹菌(P.zoysiae)引起[5]。

1.2侵染循環(huán)及流行規(guī)律 銹菌生活史中可產(chǎn)生多種類型的孢子,最多有5種，即性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔(dān)孢子。銹菌一般以夏孢子形式進(jìn)行傳播和侵染，并在草坪草寄主上存活，完成周年循環(huán)。在一個生長季，銹菌夏孢子可以連續(xù)產(chǎn)生多次，不斷傳播危害。在禾草莖葉周年存活的地區(qū)，銹菌以夏孢子或菌絲體在病部越冬。在禾草地上部分死亡的地區(qū)，銹菌則不能越冬，產(chǎn)生的冬孢子不易萌發(fā)，在侵染循環(huán)中作用不大，第2年春季由越冬地區(qū)隨氣流傳來的夏孢子引起新的侵染[6]。銹菌夏孢子的萌發(fā)和侵入適溫為15～22℃，條件適宜時潛育期一般為8～12 d,需要相對濕度為100%?；蛟诒砻嬗兴さ臈l件下萌發(fā)。因此，空氣濕度較大，降雨多或灌溉不當(dāng)、排水不良的地區(qū)銹病易流行。草坪草銹病的發(fā)病起始期及發(fā)病規(guī)律根據(jù)各地不同經(jīng)緯度及溫濕度變化有所差異。我國北方地區(qū)草坪銹病一般在7-8月為發(fā)病最嚴(yán)重的時期，并持續(xù)危害到10月；南方地區(qū)一般3-4月開始發(fā)病，4-6月和秋末冬初有2次發(fā)病高峰期[1,7-8]。在美國中部的堪薩斯州，草坪草銹病于8月或9月初發(fā)病，病情持續(xù)整個秋季[9]；而在北方的阿拉巴馬州，銹病病情分別于5月和7月達(dá)到高峰期[10]。當(dāng)晝夜溫差較大，植株碳水化合物大量積累時，或者由于過量施用氮肥使草坪草細(xì)胞組織更加肉質(zhì)多汁且細(xì)胞壁更薄的情況下，草坪草極易被病原真菌侵染，從而加重病害。此外，機(jī)械剪草和噴灌也是造成草坪銹病嚴(yán)重發(fā)生的重要因素。在機(jī)械剪草過程中，剪草機(jī)表面粘著大量病菌孢子，使病菌迅速傳播蔓延。噴灌對病菌進(jìn)一步向新葉傳播和促進(jìn)孢子萌發(fā)、侵染提供了有利條件。另外，草坪密度過大，長勢過旺，草叢的濕度增大時，也會促進(jìn)銹病流行，而氣溫下降，病害癥狀會隨之減輕，草坪草可逐漸恢復(fù)正常生長[11]。

1.3草坪銹病防治 草坪草銹病的防治通常采用精細(xì)管理、積極預(yù)防為基礎(chǔ)，并輔以藥劑防治的方法。在藥劑防治方面，主要使用高效內(nèi)吸性殺菌劑防治銹病，這類藥劑能有效控制銹病的流行。使用較多的是三唑酮類殺菌劑，如三唑酮粉銹寧，對防治銹病有較好的庇護(hù)、治療和鏟除作用，尤其是在病菌潛伏期噴施，寄主通常不發(fā)病或只出現(xiàn)褪綠病斑[12]。另外，200倍波爾多液或放線菌酮，敵銹鈉、石硫合劑、代森鋅、70%托布津可濕性粉劑800～1 000倍液也能有效防治草坪銹病[13-14]。噴藥的適宜時期為發(fā)病前夕或初期，為防病菌抗藥性的產(chǎn)生，藥劑宜交替使用或混合噴灑。此外，科學(xué)施肥、合理排灌等措施也能有效地減少病害發(fā)生的幾率。在高爾夫球場草坪中，用竹竿或軟管除去露水是一種常見的預(yù)防措施。然而采用藥劑防治既不利于人們的健康，又對環(huán)境帶來負(fù)面影響。國內(nèi)外研究和生產(chǎn)實踐證明，種植抗銹良種是綜合控制病害最經(jīng)濟(jì)、有效、易行和利于環(huán)境安全的核心措施。因此，發(fā)掘、篩選和鑒定抗銹病草坪草種質(zhì)資源，并對其遺傳特點進(jìn)行深入研究，開展對抗銹基因的遺傳分析和分子標(biāo)記定位研究，對尋找抗銹病基因和合理使用抗病基因培育抗病性品種具有重要意義[15-16]。

2 抗銹病性狀鑒定與種質(zhì)評價

抗病性鑒定包括評價寄主品種、品系或種質(zhì)對病害抵抗或感染程度，衡量草坪草品種對銹病的抗病和發(fā)病程度，常用到反應(yīng)型(感染型)、嚴(yán)重度和普遍率等指標(biāo)。鑒定方法有自然鑒定、接種鑒定、田間成株鑒定、室內(nèi)苗期鑒定、離體鑒定等，自然鑒定所需時間較長，調(diào)查年限最好在3年以上，以減少環(huán)境因素的影響。室內(nèi)接種鑒定所需時間短，并且發(fā)病條件適宜病菌生長；針對不同植物根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)蔫b定方法，同時結(jié)合幾種方法鑒定的結(jié)果，以期獲得植物全面真實的抗病評價[17]。銹病的發(fā)生受到種質(zhì)材料的抗病能力、病原物的致病力和發(fā)病環(huán)境的影響。因此，銹病在自然條件下并非每年每地均會嚴(yán)重發(fā)生。在進(jìn)行抗病育種中，除在發(fā)病的草坪進(jìn)行直接鑒定外，有時還必須在人工接種環(huán)境下，進(jìn)行誘發(fā)鑒定。通過綜合評價抗性鑒定結(jié)果，可篩選出具有優(yōu)良抗病性的種質(zhì)資源并進(jìn)一步應(yīng)用與下一階段的品種選育。

早在20世紀(jì)50年代，歐美一些國家的草坪草育種者就開始收集和篩選優(yōu)質(zhì)的抗銹病種質(zhì)資源，并培育釋放了一系列具有抗銹性的草坪草品種。例如，高羊茅品種“Rebel”[18]、“Rebel 3D”[19]和多年生黑麥草品種“Birdie Ⅱ”[20]等。Czembor等[21]對波蘭地區(qū)采集的144份不同生態(tài)型的草地早熟禾材料進(jìn)行抗銹性評價，篩選出31份對銹病具有高抗性的材料。Welty和Barker[22]調(diào)查了20多個高羊茅品種的抗稈銹(P.graminissubsp.graminicola)性狀，發(fā)現(xiàn)一些品種在人工接種和自然感染的條件下，對銹病均表現(xiàn)出一定的抗性反應(yīng)。他們將這些品種被保留下來，作為培育抗銹品種的基礎(chǔ)群體。Studer等[23]利用溫室人工接種銹病病菌以及葉片片段檢驗(LST)2種方法，對多花黑麥草(L.multiflorum)材料的抗冠銹病(P.coronataf.sp.lolii)性狀進(jìn)行了鑒定，將結(jié)果與大田調(diào)查進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，三者間具有高度相關(guān)性，因此認(rèn)為2種方法都適用于冠銹病的抗性評價。

國內(nèi)草坪草銹病的研究起步較晚。劉金平等[24]調(diào)查分析了西南地區(qū)60份野生扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)種質(zhì)的抗銹病能力，結(jié)果表明，參試材料的抗銹性與來源地的海拔以及植株生殖枝比例呈顯著相關(guān)關(guān)系，其中40%的供試材料感染銹病，而22%的供試材料表現(xiàn)為高抗(HR)，表明野生扁穗牛鞭草抗銹病能力有豐富的遺傳基礎(chǔ)。邱英等[25]對四川地區(qū)引種馴化的野生草地早熟禾田間自然感病能力研究后，認(rèn)為篩選獲得的3～4份中抗材料可用于抗病品種的進(jìn)一步選育。何秋[26]在南京地區(qū)將結(jié)縷草屬的日本結(jié)縷草(Z.japonica)、中華結(jié)縷草(Z.sinica)、溝葉結(jié)縷草(Z.matrella)和細(xì)葉結(jié)縷草(Z.tenuifolia)4個種種內(nèi)和種間組配形成14個雜交組合，獲得68份種質(zhì)材料(16個親本和52個雜交后代)。通過對這些材料在當(dāng)?shù)劁P病(P.zoysiae)的發(fā)病規(guī)律和病情嚴(yán)重程度調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)種內(nèi)雜交后代在始病期、耐病性以及發(fā)病程度上的表現(xiàn)均優(yōu)于親本；而大部分種間雜交后代與親本差別不大。通過輻射誘變處理，獲得的40份結(jié)縷草種質(zhì)材料在抗銹病性狀上表現(xiàn)差異較大。表明輻射誘變對于結(jié)縷草抗銹性影響顯著，但作用效果有差異。例如，同一輻射劑量處理后，有的材料(Z014)的夏孢子始發(fā)期較對照推遲了1個多月，而有的材料(Z037和Z041)的夏孢子始發(fā)期卻提前了20多天。

3 抗銹病遺傳機(jī)制與品種選育

3.1遺傳機(jī)制 禾草與銹病的病原菌在長期的進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的作用機(jī)制。禾草的抗銹病性狀有多種類型，其表現(xiàn)形式、強(qiáng)度和機(jī)制有所不同。廣義的禾草抗銹性主要包括低反應(yīng)型抗銹性、數(shù)量性狀抗銹性和耐銹性等幾種[17]。

低反應(yīng)型抗銹性也稱為垂直抗銹性，是指受感染的草坪草在銹菌侵入后迅速發(fā)生過敏性壞死反應(yīng)，殺死病菌或抑制其擴(kuò)展。低反應(yīng)型抗銹性是由少數(shù)主效抗病基因控制的，抗銹病品種不易隨環(huán)境改變而發(fā)生變異，但是可因銹菌生理小種的變化而喪失抗病性。有研究[27-29]發(fā)現(xiàn)，不同草地早熟禾品種對稈銹病表現(xiàn)出從高感到高抗的不同反應(yīng)型，一些草地早熟禾品種如“Newport”等，在感染稈銹病(P.graminis)后表現(xiàn)出過敏性壞死反應(yīng)。在高羊茅[30]和貓尾草(Phleumpratense)[31]等禾本科牧草上，研究者發(fā)現(xiàn)了抗稈銹性是由顯性單基因控制的證據(jù)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，原來表現(xiàn)為抗稈銹病的草地早熟禾品種，如“Midnight”等在某些地方其抗銹性已經(jīng)喪失[32]。這表明可能出現(xiàn)了新的稈銹病原菌(P.graminis)生理小種，同時也說明草坪草低反應(yīng)型的抗銹性可能由一個到少數(shù)幾個主效基因決定。

數(shù)量性狀抗銹性的抗病評價比較復(fù)雜，涉及侵染率、潛育期、孢子堆數(shù)目和孢子堆大小以及其他因素。田間試驗表明這種抗銹性是由多個微效基因控制的，在田間自然發(fā)病條件下和成株期表現(xiàn)得尤為明顯。數(shù)量性狀抗病性的表現(xiàn)可因環(huán)境條件不同而有較大差異，一般不會因小種區(qū)系的變化而改變，是一種較持久的抗病性。研究表明，多年生黑麥草冠銹病的抗性遺傳既有質(zhì)量性狀抗性特征，又具有數(shù)量性狀抗性特點[33-35]。Reheul和Ghesquiere[36]研究表明，多年生黑麥草冠銹病的發(fā)生受環(huán)境影響較大，抗冠銹病性狀的狹義遺傳力為0.46，在改進(jìn)抗性方面存在較大的潛力。通過可控條件的溫室內(nèi)人工接種試驗和田間試驗相結(jié)合，目前已經(jīng)命名2個抗多年生黑麥草冠銹病主效基因位點Cr1和Cr2[37]，并已定位抗病的數(shù)量性狀位點(QTL)在相應(yīng)的連鎖群LG 1-7連鎖群上[38-41]。

耐銹性是指某些品種所具有的在感染銹病時發(fā)病期遲，潛育期較長，發(fā)病率和嚴(yán)重度低，具有慢銹或遲銹的特點，產(chǎn)量損失顯著低于感病品種的特性。Rose-Fricker 等[42]觀察發(fā)現(xiàn)，感染稈銹病的6個多年生黑麥草雜交組合材料，具有潛育期長，病情發(fā)展緩慢等慢銹特點，并表現(xiàn)出越親分離(transgressive segregation)的特點，表明其耐銹性可能由多個基因控制。

3.2常規(guī)育種進(jìn)展 草坪草抗病品種的選育核心是室內(nèi)接種及田間自然感染相結(jié)合的方法篩選抗性材料，而輪回選擇和雜交育種是目前應(yīng)用得最為廣泛的抗病品種選育方法。通過多個抗性材料自由授粉，獲得輪回選擇原始群體，根據(jù)有重復(fù)的小區(qū)試驗評價后代系，選出最優(yōu)個體，將最優(yōu)個體進(jìn)行相互雜交重組形成新的群體。經(jīng)過如此循環(huán)進(jìn)行多輪選擇，群體中優(yōu)良基因的頻率不斷提高，最終達(dá)到改良群體的目標(biāo)。

Wofford和Watson[43]通過雙列雜交法(diallel cross)，測定了6個高羊茅親本的抗冠銹性狀表現(xiàn)，表明供試親本的特殊配合力具有顯著差異，抗性具有非加性基因作用。通過在由多個高羊茅種質(zhì)材料組成的混合群體中進(jìn)行一輪混合選擇，發(fā)現(xiàn)地中海種質(zhì)材料具有較高的抗性，這些材料抗銹性性狀的遺傳力范圍為0.07～0.52，而且不同的種質(zhì)群體具有不同的抗性基因組成。Barker和Welty[44]選用對稈銹病具有抗性的20株草坪型高羊茅，通過多元雜交(polycross)和開放性授粉所得的后代群體共120株材料，通過2次輪回選擇，人工接種后在可控環(huán)境中進(jìn)行抗稈銹病性狀鑒定，抗性植株由6%提高到50%，釋放了抗銹病高羊茅種質(zhì)‘ORTFRR-T94’[45]，而其抗銹性改良增幅的74%～89%是經(jīng)第1輪多元雜交選擇后達(dá)到的，表明高羊茅對稈銹病的抗性可能取決于少數(shù)主效基因。

根據(jù)以上研究可見草坪草抗銹病的有利基因在第1輪選擇中就可以得到有效累積，通過少數(shù)幾次輪回選擇就可能獲得優(yōu)良基因頻率較高、優(yōu)良基因型集中的改良群體。Meyer等[46]將多年生黑麥草抗稈銹種質(zhì)引進(jìn)至草坪型黑麥草中，經(jīng)過4輪抗銹性選擇，獲得了6個較親本抗性有顯著改進(jìn)的新育種材料。Roderick 等[47]通過回交選擇，成功將草地羊茅(F.pratensis)中的抗冠銹基因轉(zhuǎn)入二倍體多花黑麥草中，這一結(jié)果在染色體水平上也通過原位雜交得到了驗證。

3.3分子標(biāo)記技術(shù)在抗銹病育種中的應(yīng)用 傳統(tǒng)育種技術(shù)在草坪草抗銹性改進(jìn)方面取得了顯著進(jìn)展，由于草坪草大部分為異花授粉植物，群體相對雜合度高，遺傳來源較為復(fù)雜，根據(jù)表現(xiàn)型進(jìn)行抗銹病性狀的選擇，在一定程度上受環(huán)境等因素的影響。分子標(biāo)記是基于DNA水平上遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，由于分子標(biāo)記選擇不受環(huán)境條件的影響，所以能夠用較小的群體和以較少的世代選擇理想的基因型，提高育種工作的效率。

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RAPD(random amplified polymorphismic DNA)、SSR(simple sequence repeats)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)等基于PCR的DNA標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為育種者提供了由傳統(tǒng)的表現(xiàn)型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛐头治龅妮o助育種技術(shù)。通過建立作圖群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)檢測DNA多態(tài)性，分析相應(yīng)染色體座位上的分子標(biāo)記所提供的遺傳多態(tài)性信息，可以構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。利用一種物種的DNA標(biāo)記對另一種物種進(jìn)行遺傳比較作圖(comparative mapping)，可揭示不同物種基因組或基因組區(qū)域共線性(synteny)的存在，從而了解不同物種基因組結(jié)構(gòu)的相似性，可見比較作圖的研究可顯著增加物種中可供利用的遺傳標(biāo)記數(shù)量[48]。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已逐步應(yīng)用于草坪草的抗性育種當(dāng)中，通過建立遺傳連鎖圖譜，與農(nóng)作物等研究得較為深入的物種進(jìn)行比較作圖研究等都是草坪草抗病育種的重要發(fā)展方向。

目前，有關(guān)黑麥草屬牧草抗冠銹病的數(shù)量性狀位點定位與分子標(biāo)記輔助育種已取得較為深入的研究。Studer等[23]通過對雙向擬測交法(two-way pseudo-testcross)構(gòu)建包含306個植株個體的多花黑麥草作圖群體，經(jīng)過田間抗冠銹性評價，并依據(jù)包含368個AFLP和SSR標(biāo)記的連鎖圖譜，進(jìn)行了抗冠銹病QTL位點分析。結(jié)果表明，有2個抗冠銹病性狀相關(guān)的QTL位點分別位于連鎖群LG1和LG2上，兩者共同可以解釋56%的表現(xiàn)型變異，同時篩選出了與抗冠銹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為今后分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了潛在的標(biāo)記。Armstead[49]通過回交漸滲法，將二倍體草地羊茅的抗冠銹性狀轉(zhuǎn)入感銹病的四倍體多花黑麥草背景中，之后再通過回交轉(zhuǎn)入感銹病的二倍體多花黑麥草背景，利用應(yīng)用AFLP及STS分子標(biāo)記作圖，將抗冠銹病遺傳位點定位在5號染色體末端，通過對比圖譜分析發(fā)現(xiàn)該羊茅/多花黑麥草基因組與水稻(Oryzasativa)的第11、12號染色體具有遺傳保守性，并進(jìn)一步識別了與抗冠銹基因共分離的STS標(biāo)記。Dumsday等[38]應(yīng)用11個SSR分子標(biāo)記將一個多年生黑麥草抗冠銹病主效基因的位點定位于連鎖群LG2上，命名為LpPc1 (LoliumperennePucciniacoronataresistance 1)，該抗性基因位點在2個親本群體后代中表現(xiàn)出遺傳分離特點，分別解釋一個親本(Vedette6)80%的表現(xiàn)型變異，另一個親本(Victorian9)26%的表現(xiàn)型變異。Muylle等[41]應(yīng)用AFLP標(biāo)記與群分法識別了2個有效的基因組區(qū)域，一共可以解釋35%的表現(xiàn)型變異，其中一個AFLP標(biāo)記區(qū)域位于連鎖群LG2上，可以解釋6.1%的表現(xiàn)型變異；另一個標(biāo)記區(qū)域位點在連鎖群LG2以外，具體位點還不確定，可以解釋27.7%的抗病表現(xiàn)型變異。因確定的2個AFLP標(biāo)記位點僅能解釋小部分的抗病表現(xiàn)型變異，Muylle等[50]認(rèn)為在所采用的抗病性分離群體中，還存在其他基因組區(qū)域與抗病性狀有關(guān)。Muylle等[50]利用包含252個單株的多年生黑麥草作圖群體，采用雙向擬測交方法，構(gòu)建了一個具有227個分子標(biāo)記位點(RFLP，STS，AFLP和SSR標(biāo)記)總圖距為744 cM的連鎖圖譜。通過遺傳連鎖圖譜進(jìn)行QTL分析，發(fā)現(xiàn)有4個遺傳區(qū)域與冠銹病抗性有關(guān)，其中2個位于LG1(LpPc4和LpPc2)上，2個位于LG2(LpPc3和LpPc1)上，分別能解釋12.5%、24.9%、5.5%和2.6%的抗銹病表現(xiàn)型變異。同時，通過與禾谷類作物的比較基因組學(xué)方法分析表明，多年生黑麥草的LG1和LG2連鎖群與燕麥(Avenasativa)的A和B染色體，以及小麥1號染色體組具有同源性，其中燕麥A和B染色體上具有抗冠銹病的基因位點，小麥1號染色體上具有葉銹病基因位點。Schejbel等[51]也通過雙向擬測交法構(gòu)建包含184個基因型的多年生黑麥草作圖群體，并通過2年的田間性狀觀測、室內(nèi)離體葉片病原菌接種檢驗(LST)以及2種方法相結(jié)合評價抗冠銹病性狀，3種方法測定抗冠銹病性狀的廣義遺傳力分別為0.42、0.56和0.64。共識別了位于LG1，LG4和LG5連鎖群上的抗冠銹病QTL位點6個，但這些位點對表現(xiàn)型變異的解釋較小，為6.8%～16.4%，表明該研究所采用的作圖群體中缺失抗冠銹病的主效基因。由以上研究結(jié)果可以看出，多年生黑麥草抗冠銹病基因連鎖標(biāo)記位點的數(shù)量、在連鎖群當(dāng)中的位置和解釋表現(xiàn)型變異的大小都與所采用的分離群體、群體大小和標(biāo)記密度等存在密切的關(guān)系。

4 問題與展望

草坪基于其獨特的生態(tài)、社會、景觀、美學(xué)和經(jīng)濟(jì)等功能，越來越被重視并顯示出其巨大的發(fā)展勢頭和潛力。草坪草絕大多數(shù)為多年生的植物，由于種類的相對穩(wěn)定和大面積種植給病害的流行制造了有利的機(jī)會，隨著我國草坪業(yè)的興起，草坪規(guī)模的擴(kuò)大，草坪病害研究和防治工作日趨重要[52]?，F(xiàn)在國內(nèi)外對草坪草銹病已有不少研究報道，并采用多種育種手段進(jìn)行抗病育種，選育出不少坪用品質(zhì)優(yōu)異、抗病性較強(qiáng)的品種。但是與主要農(nóng)作物如小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、燕麥等抗銹育種研究相比，草坪草抗銹病性狀的研究還需在廣度和深度上進(jìn)一步加強(qiáng)。

目前國內(nèi)對于草坪草銹病的研究報道較少，且研究方向多集中于病原物鑒定、癥狀、發(fā)病規(guī)律、發(fā)生區(qū)域和防治方法等基礎(chǔ)調(diào)查方面，抗銹育種研究在國內(nèi)還鮮見報道。國外對于草坪草銹病的研究多集中于多年生黑麥草冠銹病上，并對其抗病遺傳機(jī)制和抗病基因的篩選及定位做了大量工作，為今后草坪草銹病研究打下了很好的基礎(chǔ)。

我國地域廣闊，氣候條件差異大，草坪草種質(zhì)資源十分豐富，對我國草坪草資源進(jìn)行抗銹性調(diào)查，篩選和收集來源豐富的抗銹種質(zhì)資源，是草坪草抗銹新品種選育的基礎(chǔ)。草坪草銹病的病原菌生理小種及專化型有待進(jìn)一步深入研究，通過研究草坪草銹菌的致病性分化，對銹菌的抗銹性生化機(jī)制深入了解，包括尋找抗銹基因的初級產(chǎn)物和解釋寄主與銹菌間的特異性識別作用等，選用合適的手段深入開展草坪草抗銹育種。隨著新的病原生理小種的出現(xiàn)，植株材料原有的抗源可能喪失抗病性，應(yīng)不斷地尋找新的抗性種質(zhì)材料，豐富抗源類型，用抗源的多樣性保持病原變異的穩(wěn)定性。另外應(yīng)該注重對數(shù)量性狀抗性的研究，通過聚合多個抗銹基因，使草坪草能夠維持長期穩(wěn)定的品種抗銹性。

由于傳統(tǒng)的育種手段受到草坪草復(fù)雜的遺傳背景以及環(huán)境、生長期等條件限制，選育抗病新品種時間長，效率低。而一些分子生物技術(shù)已應(yīng)用到草坪草育種當(dāng)中，幾種主要的草坪草都已構(gòu)建了遺傳圖譜[53-54]。因此，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行抗銹基因的篩選和定位，同時隨著功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)的發(fā)展，也可以借鑒其他屬種植物研究中的成果來推動草坪草抗銹機(jī)制、抗銹育種的研究。利用目標(biāo)性狀基因與分子標(biāo)記之間的緊密連鎖關(guān)系進(jìn)行間接的分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection)，在定位目的基因構(gòu)建群體時做到既是遺傳群體又是育種群體，使基因定位于標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響,同時又可避免等位基因間顯隱性關(guān)系的干擾，獲得可靠的選擇結(jié)果，從而大大縮短育種周期，提高優(yōu)良品質(zhì)育種效率。

[1] 何秋,劉建秀.我國暖季型草坪草銹病的研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源，2005,24(2):9-11.

[2] 裴寶紅.北方幾種冷季型草坪草病害及病原種類[J].科研與技術(shù)，2007(10)：61-64.

[3] 楊金紅.我國冷季性草坪草銹病的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(13):158-159.

[4] 王云章，莊劍云．中國真菌志：第十卷 銹菌目(一)[M]．北京:科學(xué)出版社，1998：24-172．

[5] Cummis G B，Hiratsuka Y.Illustrated Genera of Rust Fungi [M].Revised edition.St Paul，Minnesota：American Phytopathological Society，1983.

[6] 董厚德，宮莉君，王艷,等.中國結(jié)縷草生態(tài)學(xué)及其資源開發(fā)與應(yīng)用[M].北京：中國林業(yè)出版社，2001.

[7] 何秋，劉建秀，侯慶樹.南京地區(qū)結(jié)縷草屬植物銹病病原物鑒定及其發(fā)病規(guī)律的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(6)：155-157.

[8] 翁啟勇,王青松,何玉仙,等.福建草坪草病害初報[J].草業(yè)學(xué)報，1997，6(2)：70-73.

[9] Obasa K，Kennelly M.Rust Diseases of Turfgrasses[EB/OL].(Revised April 2010) Kansas State University Agricultural Experiment Station and Cooperative Extension Service EP-163，http://www.ksre.ksu.edu/library/plant2/ep163.pdf.

[10] Hagan A.Leaf spot and rust diseases of turfgrasses[EB/OL].(Revised May 2005) Alabama Cooperative Extension System ANR-621，http://www.aces.edu/pubs/docs/A/ANR-0621/ANR-0621.pdf.

[11] 商鴻生，王鳳葵． 草坪病蟲害及其防治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[12] 周玉鋒，尚以順.貴州足球場草坪主要病蟲害發(fā)生及防治[J].草原與草坪，2001(1):51-53.

[13] 紹玲.冬綠細(xì)葉結(jié)縷草銹病的防治[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2005(10):51.

[14] 何惠琴，干友民，吳勇剛.四川盆地常見草坪病害與防治[J].四川草原，2002(4):48-52.

[15] 何秋,劉建秀.草坪草真菌病害的研究進(jìn)展[J]草業(yè)科學(xué)，2006,23(4)：10-14.

[16] 陳吉虎,趙永軍,高旭彪，等.北京地區(qū)冷季型草坪草病害調(diào)查及防治[J]草業(yè)科學(xué)，2007,24(12)：103-106.

[17] 李振岐，曾士邁.中國小麥銹病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:164-165.

[18] Funk C R，Dickson W K，Hurley R H.Registration of ‘Rebel’ tall fescue[J].Crop Science，1981,21：632.

[19] Hurley R H，Lehman V G，Meyer W A，etal.Registration of ‘Rebel 3D’ tall fescue[J].Crop Science，1995，35:1215.

[20] Meyer W A，Rose-Fricker C A.Registration of ‘Birdie Ⅱ’perennial ryegrass[J].Crop Science，1990,30:1158-1159.

[21] Czembor E，F(xiàn)euerstein U，Zurek G.Preliminary observations on resistance to rust diseases of kentucky bluegrass ecotypes from Poland [J].Journal of Phytopathology，2001，149(2)：83-89.

[22] Welty R E，Barker R E.Reaction of twenty cultivars of tall fescue to stem rust in controlled and field environments[J].Crop Science，1993，33(5):963-967.

[23] Studer B，Boller B，Bauer E，etal.Consistent detection of QTLs for crown rust resistance in Italian ryegrass (LoliummultiflorumLam.) across environments and phenotyping methods[J].Theoretical and Applied Genetics，2007,115(1):9-17.

[24] 劉金平,張新全,游明鴻，等.西南地區(qū)扁穗牛鞭草種質(zhì)資源抗銹病能力初步研究[J].草業(yè)學(xué)報,2006，15(4):65-70.

[25] 邱英，彭燕，干友民,等.野生草地早熟禾引種馴化抗銹病能力初探[J].北方園藝，2007(6)：129-131.

[26] 何秋.結(jié)縷草屬(ZoysiaWilld.)植物種質(zhì)資源的銹病危害及抗病性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:29-41.

[27] Britton M P，Butler J D.Resistance of seven Kentucky bluegrass varieties to stem rust[J].Plant Disease reporter，1965,49(8):708-710.

[28] Pflegler F L.Reaction ofPoapratensisintroductions toPucciniagraminis[J].Plant Disease Reporter，1973，57(7):595-598.

[29] Watkins J E，Shearman R C,Houfek J A，etal.Response of Kentucky bluegrass cultivars and blends to a natural stem rust population[J].Plant Disease，1981，65(4):345-347.

[30] Barker R E，Welty R E.Selection for stem rust resistance in tall fescue[A].In:Young W C.III.1995 Seed Production Research at Oregon State University，Ext/CrS 106[C].Corvallis：Oregon State University，1996：39-40.

[31] Braverman S W.Sources of resistance to stem and leaf rust amongPhleumspecies[J].Plant Disease Reporter,1965，50(11):849-851.

[32] Fraser M L，Rose-Fricker C A，Rector J.Reaction of Kentucky bluegrass to stripe rust and stem rust [EB/OL].St Paul，Minnesota：American Phytopathological Society，Biological and Cultural Tests for Control of Plant Diseases.2001，18:T002，http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/trial/bctests/vol18/.

[33] Wilkins P W.Inheritance of resistance toPucciniacoronatCorda andRhynchosporiumorthosporumCaldwell in Italian ryegrass[J].Euphytica，1975,24(1)：191-196.

[34] Posselt U K.Genetic aspects of crown rust resistance in the ryegrasses[A].In：Krohn K，Paul V H，Thomas J.International congress on harmful and beneficial micro-organisms in grasslands,pastures and turf[C].Montfavet:International congress on harmful and beneficial micro-organisms in grasslands, pastures and turf, 17th edn,1994:229-235.

[35] Kimbeng C A.Genetic basis of crown rust resistance in perennial ryegrass，breeding strategies，and genetic variation among pathogen populations：A review[J].Australian Journal of Experimental Agriculture，1999,39(3)：361-378.

[36] Reheul D，Ghesquiere A.Breeding perennial ryegrass with better crown rust resistance[J].Plant Breeding 1996,115(6):465-469.

[37] Lellbach H.Resistance to crown rust of ryegrass cultivars tested in the field (EUCARPIA multisite rust evaluation) and in situ(leaf-segment test)[J].Proceedings Czech Journal of Genetics and Plant Breeding，2003，39 (special issue)：9-11.

[38] Dumsday J L，Smith K F，F(xiàn)orster J W，etal.SSR-based genetic linkage analysis of resistance to crown rust (Pucciniacoronataf.sp.lolii) in perennial ryegrass (Loliumperenne)[J].Plant Pathology，2003，52(5):628-637.

[39] Roderick H W，Humphreys M O，Turner L，etal.Isolate specific quantitative trait loci for resistance to crown rust in perennial ryegrass[J].Vortr Pflanzenzüchtg，2003，59:244-247.

[40] Sim S C，Chang T，Curley J，etal.Genetic Dissection of Genes Controlling Resistance to Crown Rust in Ryegrass[C].San Diego，CA：Plant & Animal Genomes XIII Conference,2005:334.

[41] Muylle H，Baert J，Van Bockstaele E，etal. Four QTLs determine crown rust (Pucciniacoronataf.sp.lolii) resistance in a perennial ryegrass (Loliumperenne) population[J].Heredity,2005，95(5)：348-357.

[42] Rose-Fricker C A，Meyer W A，Kronstad W A.Inheriance of resistance to stem rust in six perennial ryegrass crosses[J].Plant Disease，1986,70(7):678-681.

[43] Wofford D S，Watson C E.Inheritance of crown rust resistance in tall fescue[J].Crop Science，1982，22(3):510-512.

[44] Barker R E，Welty R E.Registration of ORTFRR-T94 and ORTFRR-F94 tall fescue germplasm with resistance to stem rust[J].Crop Scienc,1997，37(3):1034-1035.

[45] Barker R E，Pfender W F，Welty R E.Selection for stem rust resistance in tall fescue and its correlated response with seed yield[J].Crop Science,2003，43(1):75-79.

[46] Meyer W A，Rose-Fricker C A，Van A J P.Breeding for resistance to crown and stem rust in perennial ryegrass[C].Avignon,France：In Proceeding of the 5thInternational Turfgrass Research Conference，1985:227-233.

[47] Roderick H W，Morgan W G，Harper J A.Introgression of crown rust (Pucciniacoronata) resistance from meadow fescue (Festucapratensis) into Italian ryegrass (Loliummultiflorum) and physical mapping of the locus[J].Heredity 2003，91(4)：396-400.

[48] 方宣鈞,吳為人，唐紀(jì)良.作物DNA標(biāo)記輔助育種[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[49] Armstead I P.Introgression of crown rust (Pucciniacoronata) resistance from meadow fescue (Festucapratensis) into Italian ryegrass (Loliummultiflorum)：genetic mapping and identification of associated molecular markers[J].Plant Pathology，2006,55(1):62-67.

[50] Muylle H，Baert J，Van Bockstaele E，etal.Identification of molecular markers linked with crown rust resistance in perennial ryegrass (Loliumperenne) using AFLP markers and a bulked segregant approach[J].Euphytica，2005，143(1-2):135-144.

[51] Schejbel B，Jensen L B，Xing Y，etal.QTL analysis of crown rust resistance in perennial ryegrass under conditions of natural and artificial infection[J].Plant Breeding，2007,126(4):347-352.

[52] 陳蘊，吳開賢，羅富成.我國草坪草引種研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2008,25(10)：128-132.

[53] 解新明，盧小良.SSR和ISSR標(biāo)記及其在牧草遺傳與育種研究中的應(yīng)用前景[J].草業(yè)科學(xué)，2005，22(2):22-26.

[54] 鄭軼琦,劉建秀.草坪草分子遺傳圖譜的構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報，2009，18(1)：155-162.