布氏乳桿菌對(duì)青貯發(fā)酵及其效果的研究進(jìn)展

洪梅，刁其玉＊，姜成鋼，閆貴龍，屠焰，張乃鋒

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口075000）

青貯飼料以其氣味芳香、柔嫩多汁而且適口性好等特點(diǎn)，已經(jīng)被人們接受并使用，目前，我國青貯飼料產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展，幾乎所有的大、中、小型奶牛場所用的粗飼料都是以青貯飼料為主。青貯的原理是在厭氧條件下，通過附著于植物體的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸（主要是乳酸），迅速降低pH值，從而殺滅或抑制各種微生物的活動(dòng)，達(dá)到長期保存青綠飼料的目的［1］。隨著青貯飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們基本已經(jīng)能夠制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料，但是，飼料的腐敗變質(zhì)卻一直是生產(chǎn)實(shí)踐中的一個(gè)較難解決的問題。

目前很多農(nóng)場的青貯飼料在飼喂前和飼喂過程中都會(huì)發(fā)生不同程度的有氧腐敗。因?yàn)槊看物曃箘?dòng)物前取料勢(shì)必會(huì)延長飼料暴露在空氣中的時(shí)間；而在一些農(nóng)戶家中，往往是每2～3天投料1次，這樣更是大大增加了青貯飼料腐敗變質(zhì)的幾率。已經(jīng)腐敗變質(zhì)的飼料會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)的損失，而且還會(huì)產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，間接影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能，進(jìn)而降低農(nóng)民的凈收入。當(dāng)青貯飼料在飼喂與貯存時(shí)，一旦接觸空氣，條件性致病菌開始變得活躍，消耗飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)同時(shí)開始產(chǎn)熱，引起青貯飼料的腐敗變質(zhì)。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，盡可能減少有氧變質(zhì)帶來的損失、提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性、延遲二次發(fā)酵以保持青貯料的品質(zhì)具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，有些酵母菌如假絲酵母、隱球酵母以及畢赤酵母屬等，能夠利用乳酸，引起飼料pH值的升高［2，3］，它們被認(rèn)為是引起青貯飼料腐敗變質(zhì)的元兇，而霉菌、芽孢桿菌甚至乳酸菌也會(huì)在某種程度上引起飼料的腐敗變質(zhì)［4］。

人們嘗試過很多方法，試圖防止青貯飼料的腐敗變質(zhì)，延長飼料保存時(shí)間。例如，Kung等［5］曾使用丙酸作為添加劑以提高青貯玉米的有氧穩(wěn)定性。張濤等［6］在苜蓿裹包青貯中，通過添加青貯菌劑來提高青貯產(chǎn)物中乙酸含量，抑制酵母菌和霉菌數(shù)量，有助于提高青貯產(chǎn)物的有氧穩(wěn)定性。傅彤［7］使用有機(jī)酸（乙酸和丙酸）有效提高了青貯玉米的有氧穩(wěn)定性。另外，山梨酸作為一種防腐劑，也能夠抑制酵母菌和霉菌的生長。Wyss等［8］發(fā)現(xiàn)添加2g／kg山梨酸鉀于黑麥草（Loliumperenne）青貯中，提高了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。自從1996年Muck［9］首次證明，布氏乳桿菌（Lactobacillusbuchneri）可以提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性以來，很多學(xué)者對(duì)此展開了研究。以下就布氏乳桿菌對(duì)青貯發(fā)酵、青貯質(zhì)量、動(dòng)物生產(chǎn)性能，特別是其對(duì)青貯飼料的有氧穩(wěn)定性方面的影響進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 布氏乳桿菌對(duì)青貯發(fā)酵的影響

1995年以前，人們一直認(rèn)為布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料品質(zhì)的作用微不足道。然而，這一看法很快被眾多學(xué)者推翻，據(jù)Beck［10］報(bào)道，保存良好的青貯飼料中，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌僅在發(fā)酵的前4d占主導(dǎo)地位，之后布氏乳桿菌和短乳桿菌逐漸取代它們，成為主導(dǎo)菌群。另外，Garzia和Giovanna［11］在23個(gè)青貯樣本中分離出40株乳酸菌和球菌，其中33株屬于異型發(fā)酵，而且數(shù)目最多的依次是布氏乳桿菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。Bucher［12］發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，他從青貯飼料中分離出2 124株乳酸菌，其中707株是布氏乳桿菌。以上結(jié)果說明，布氏乳桿菌在飼料發(fā)酵過程中起著非常重要的作用，至少在發(fā)酵后期是主導(dǎo)菌群。

傳統(tǒng)意義上的青貯接種劑，即同型發(fā)酵乳酸菌，通過增加乳酸的生成量以及乳乙酸生成比例，使青貯飼料的pH值迅速下降［13－16］。布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，它對(duì)青貯飼料發(fā)酵的影響主要是降低乳酸的含量，增加乙酸的生成量，最終使青貯飼料的pH值相對(duì)較高。Kung和Stokes［17］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)青貯飼料中乳乙酸的生成比例大于3時(shí)，一般是同型發(fā)酵乳酸菌占主導(dǎo)地位。Ward［18］也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。然而，布氏乳桿菌卻不符合這一標(biāo)準(zhǔn)。Kleinschmit和Kung［19］在小粒谷物青貯時(shí)，添加2種劑量的布氏乳桿菌（分別是LB1≤105cfu／g，LB2＞105cfu／g），結(jié)果表明，對(duì)照組的乳乙酸生成比例是5.3∶1.0，而LB1組顯著降低到0.8∶1.0，LB2組則更低，下降到0.6∶1.0。Driehuis等［20］也有類似的研究結(jié)果，用L.buchneri40788處理飼料，結(jié)果降低了乳乙酸的生成比例，而且部分青貯飼料中乙酸含量甚至超過了乳酸含量。

1.1 布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響

青貯飼料暴露于空氣中會(huì)腐敗變質(zhì)，酵母菌被認(rèn)為是引起飼料變質(zhì)的元兇，它能夠利用乳酸發(fā)酵，引起青貯飼料的pH值升高，從而引起條件性細(xì)菌和真菌的生長繁殖，進(jìn)一步加劇飼料腐?。?1］。青貯飼料在青貯窖或飼槽中保持新鮮（不變質(zhì)）的能力通常用有氧穩(wěn)定性表示。有氧穩(wěn)定性是指青貯飼料暴露于空氣中，飼料溫度高于環(huán)境溫度2℃所需要的時(shí)間。關(guān)于布氏乳桿菌，很多學(xué)者研究了它與各種青貯飼料有氧穩(wěn)定性的關(guān)系，包括玉米（Zeamays）［22－25］、禾本科牧草［20］、苜蓿（Medicagosativa）［26］、整株小麥（Triticumaestivum）［27］、整株大麥（Hordeumvulgare）［28，29］、高水分玉米［30，31］、高粱（Sorghumvulgare）［27］和王草（Pennisetumpurpureum×P.typhoideum）［32］。這些研究結(jié)果表明，布氏乳桿菌可以明顯改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。盡管其對(duì)有氧穩(wěn)定性的提高程度不盡相同，從一天到數(shù)周不等，但所表現(xiàn)的積極效應(yīng)是穩(wěn)定的。另外，雖然有些研究結(jié)果中，布氏乳桿菌沒有明顯改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，但是當(dāng)處理后的青貯飼料與其他飼料混合后，全混合日糧的有氧穩(wěn)定性卻顯著提高［26，31］。

乙酸是很好的抗真菌物質(zhì)，其含量的增加能夠抑制青貯飼料中酵母的生長繁殖［33］。Kleinschmit和Kung［19］將布氏乳桿菌添加到青貯玉米和青貯小谷物中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌處理后青貯玉米中的酵母菌數(shù)量僅為處理組的1／10，而且隨著布氏乳桿菌添加劑量的增加，青貯玉米中酵母菌的數(shù)量顯著降低。但是，需要注意的是，小谷物青貯未添加布氏乳桿菌組的酵母菌數(shù)量也很低，所以小谷物青貯對(duì)照組的有氧穩(wěn)定性相對(duì)較高。布氏乳桿菌作為添加劑提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性是通過抑制環(huán)境中酵母菌的生長而實(shí)現(xiàn)的。完全理想的情況下，青貯玉米和青貯小谷物的有氧穩(wěn)定性都要高于飼料飼喂前可能暴露于空氣中的時(shí)間（12～24h）。然而，自然條件下，飼喂前和飼喂過程中，空氣總是能夠通過各種途徑滲透進(jìn)青貯飼料中，如容器裂縫、每次取樣時(shí)打開青貯窖、青貯料與青貯窖之間的縫隙等，因此，更應(yīng)該注重有氧穩(wěn)定性的相對(duì)值。

近幾年有人發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素或類細(xì)菌素，這些物質(zhì)可能也有助于提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中，通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽；這些物質(zhì)可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物，如細(xì)菌素（Buchnericin，LB）只對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌則無抑制作用［34］。類細(xì)菌素是指不符合或不完全符合細(xì)菌素定義的蛋白類拮抗物質(zhì)，它不僅能抑制革蘭氏陽性菌，而且對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌也有抑制作用。常峰等［35］研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌CF10所產(chǎn)類細(xì)菌素Lactobacillin FC－10在酸性條件下穩(wěn)定且活性高，對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母菌和真菌有明顯的抑制作用。貢漢生等［36］從乳制品中篩選得到一株產(chǎn)類細(xì)菌素的布氏乳桿菌KLDS1.0364，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KLDS1.0364產(chǎn)生的類細(xì)菌素的作用方式是殺菌，且抑菌譜廣，并可抑制多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌。迄今為止，布氏乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和類細(xì)菌素都只是處于理論研究階段，并沒有真正作為添加劑使用。

布氏乳桿菌將乳酸降解成乙酸的過程中，同時(shí)伴有丙二醇的生成［37］。丙二醇的含量通常占干物質(zhì)含量的2%～4%［20，38－40］，它能夠通過某些有機(jī)物被轉(zhuǎn)化成丙酸，但是布氏乳桿菌卻沒有這種功能［22］。Krooneman等［41］從青貯飼料中分離出一株乳酸菌Lactobacillusdiolivorans，含有二醇脫激酶因子，能夠?qū)⒈冀到馍傻犬?dāng)量的1－丙醇和丙酸，而丙酸是大家公認(rèn)的抗真菌物質(zhì)。然而，并不是所有的青貯飼料中都有同樣的情況發(fā)生，例如，Driehuis等［20］在干物質(zhì)含量為23%的青貯黑麥草中檢測到了較多的1－丙醇和丙酸，但是當(dāng)黑麥草干物質(zhì)含量為35%時(shí)，并沒有這些發(fā)酵產(chǎn)物的生成，相反地，卻檢測到大量的丙二醇。Kleinschmit和Kung［19］的研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌對(duì)青貯玉米中丙酸的含量并無影響，但是卻增加了青貯小谷物和青貯牧草中丙酸的含量。由此顯示，不同作物將丙二醇轉(zhuǎn)化成丙酸的能力不同。

1.2 布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料中乙醇和可溶性碳水化合物含量的影響

布氏乳桿菌對(duì)不同作物青貯后乙醇含量和可溶性碳水化合物的含量也有不同的影響。如Kung等［26］的結(jié)果顯示，布氏乳桿菌處理組青貯苜蓿的乙醇含量與對(duì)照組相比顯著增加，Kleinschmit和Kung［19］用布氏乳桿菌處理后，青貯小谷物飼料中的乙醇含量和碳水化合物的含量都有所增加，但是青貯玉米中二者的含量變化卻不顯著。分析其原因，可能有二。首先，或許布氏乳桿菌能夠增加青貯玉米中乙醇的生成量，但是，其增加的量遠(yuǎn)不及青貯玉米本身所含的酵母菌生成的乙醇的量，所以，結(jié)果表現(xiàn)為差異不顯著；其次，有研究表明［37］，布氏乳桿菌在pH 3.8（約等于青貯玉米的pH值）時(shí)比pH 4.3（約等于小谷物青貯的pH值）時(shí)更容易利用碳水化合物進(jìn)行異型發(fā)酵，這樣必然會(huì)降低青貯小谷物中碳水化合物的含量，而增加乙醇的生成量。

2 布氏乳桿菌對(duì)干物質(zhì)回收率和動(dòng)物采食量的影響

目前人們已經(jīng)肯定并接受了布氏乳桿菌對(duì)于青貯飼料有氧穩(wěn)定性的積極作用，但是仍然有學(xué)者認(rèn)為其造成了干物質(zhì)的損失［42］，而且使用布氏乳桿菌后，青貯飼料中產(chǎn)生的高劑量乙酸會(huì)影響飼料的適口性，降低動(dòng)物的采食量，進(jìn)而影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能［43］。很多學(xué)者做了相關(guān)的研究，結(jié)果表明，用布氏乳桿菌處理過的青貯飼料飼喂奶牛［20，31］和綿羊［25］，動(dòng)物的干物質(zhì)采食量并沒有受到影響。Kung等［26］的研究表明，布氏乳桿菌不僅沒有限制動(dòng)物的采食量，而且增加了產(chǎn)奶量。

同型發(fā)酵乳酸菌在飼料青貯過程中會(huì)造成2%～6%的干物質(zhì)損失，能量損失則更少；而異型發(fā)酵過程中，因?yàn)橛卸趸嫉纳?，干物質(zhì)損失相對(duì)較高，5%～24%不等，能量損失則通常低于2%。Weinberg等［44］測定了不同處理間（植物乳桿菌組、布氏乳桿菌組以及二者聯(lián)合應(yīng)用組）二氧化碳的生成量，結(jié)果顯示，青貯全株小麥中，植物乳桿菌組的二氧化碳含量高于其他各組。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌組相對(duì)較多的酵母和霉菌產(chǎn)生二氧化碳的結(jié)果。然而，布氏乳桿菌組很好地抑制了這些有害菌的生長繁殖，所以生成的二氧化碳的總量顯著少于植物乳桿菌組。Kleinschmit和Kung［19］的試驗(yàn)結(jié)果顯示，布氏乳桿菌處理組青貯玉米的干物質(zhì)損失比對(duì)照組高1.0%，而處理組青貯小谷物的干物質(zhì)損失比對(duì)照組大約高1.5%。1.0%～1.5%的干物質(zhì)損失與飼料腐敗變質(zhì)引起的損失相比是微不足道的。這些結(jié)果表明，布氏乳桿菌造成的干物質(zhì)損失是可以忽略的，而且能夠有效提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，對(duì)制作優(yōu)質(zhì)青貯具有重要意義［45］。

3 布氏乳桿菌使用效果分析

布氏乳桿菌對(duì)于青貯飼料的影響與青貯原料和添加劑量有很大關(guān)系。Kleinschmit和Kung［19］報(bào)道，布氏乳桿菌添加量大于105cfu／g時(shí)，接種劑對(duì)玉米青貯的效果要好于禾本科牧草和小顆粒谷物飼料；而且隨著添加量的增加，3種青貯飼料的有氧穩(wěn)定性都逐步提高。Ranjit和Kung［24］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)布氏乳桿菌的接種量為106cfu／g時(shí)，青貯飼料的有氧穩(wěn)定性顯著高于苯甲酸鹽和丙酸添加劑的效果。然而，當(dāng)接種量為105cfu／g時(shí)，其效果要低于苯甲酸鹽和丙酸。另外，Kung和Ranjit［29］證明，如果添加量小于5×105cfu／g，那么布氏乳桿菌不能顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)椋际先闂U菌的添加劑量不足以使其成為青貯飼料的主導(dǎo)菌群。

Schmidt等［46］分別用布氏乳桿菌和植物乳桿菌處理飼料，測定了發(fā)酵第240天青貯飼料中乳酸菌的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的數(shù)量隨著植物乳桿菌添加量的增加而顯著增加，但是當(dāng)布氏乳桿菌的接種量增加時(shí)，并沒有出現(xiàn)相同的結(jié)果，這說明發(fā)酵第240天，布氏乳桿菌成為飼料中的主導(dǎo)菌群。Schmidt等［46］和Mari等［47］同樣發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌處理的青貯玉米與對(duì)照組相比，乳酸菌的數(shù)量顯著增加，而且通過實(shí)時(shí)定量PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）方法測定可以發(fā)現(xiàn)處理組中布氏乳桿菌的數(shù)量顯著增加。

目前，很多學(xué)者研究了布氏乳桿菌與酶聯(lián)合應(yīng)用效果。例如，Taylor和Kung［48］在高水分玉米青貯中同時(shí)添加布氏乳桿菌和酶，結(jié)果青貯飼料的有氧穩(wěn)定性顯著提高。然而，Ebling［49］的試驗(yàn)結(jié)果與之不一致，因?yàn)棣拢暇厶敲浮ⅵ粒矸勖?、木聚糖酶和半乳甘露糖酶與布氏乳桿菌聯(lián)合應(yīng)用并沒有提高青貯玉米的有氧穩(wěn)定性。除此之外，布氏乳桿菌與同型發(fā)酵乳酸菌的聯(lián)合使用也是近期研究的熱點(diǎn)。Weinberg等［44］為檢驗(yàn)植物乳桿菌和布氏乳桿菌對(duì)全株小麥和玉米青貯的影響，將試驗(yàn)分為4組，即A（對(duì)照組，不添加微生物接種劑），B（只添加植物乳桿菌組）、C（只添加布氏乳桿菌組）以及D（布氏乳桿菌和植物乳桿菌聯(lián)合應(yīng)用組）。青貯3個(gè)月后，D組青貯小麥的乙酸含量最高，而且沒有霉菌生長；而對(duì)照組和B組的青貯飼料表層有霉菌生長。但是青貯玉米中，C組即只添加布氏乳桿菌組，飼料表層有霉菌生長，但是與對(duì)照組相比，有氧穩(wěn)定性仍然較高，酵母菌數(shù)量較少，二氧化碳的生成量也相對(duì)較少。

4 布氏乳桿菌的前景展望

以前的研究中，布氏乳桿菌的計(jì)數(shù)通常采用傳統(tǒng)的MRS（de Man，Rogosa，and Sharpe agar）培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，但這種方法有很大的局限性，因?yàn)樵贛RS培養(yǎng)基上所有的乳酸菌都能夠生長，所以無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)布氏乳桿菌和其他乳酸菌的數(shù)量，從而給研究工作帶來很多不便。近幾年興起的實(shí)時(shí)定量PCR方法能夠很好的解決這一問題，Schmidt等［46］采用這種方法發(fā)現(xiàn)青貯過程中，布氏乳桿菌和植物乳桿菌的消長關(guān)系，并且通過對(duì)布氏乳桿菌的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，直到青貯后期布氏乳桿菌才成為主導(dǎo)菌群。所以，實(shí)時(shí)定量PCR方法值得在青貯研究過程中推廣并使用。

另外，隨著人們對(duì)布氏乳桿菌作用的認(rèn)可，越來越多的生產(chǎn)者開始使用這種微生物添加劑，但是其作用機(jī)理仍然不是很明確，特別是近年來發(fā)現(xiàn)有些布氏乳桿菌能夠產(chǎn)生類細(xì)菌素，它們能夠有效地抑制革蘭氏陰性菌和真菌，但目前僅限于理論研究階段，如果將這些類細(xì)菌素開發(fā)成添加劑直接應(yīng)用在生產(chǎn)中，相信意義更為深遠(yuǎn)。

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