Wnt信號通路與腎臟纖維化

周寶尚 綜述,張 璟審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科/全軍腎臟病中心/重慶市腎病研究所,重慶 400037)

腎小管間質(zhì)纖維化是各種不同病因的慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路,是導(dǎo)致終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)。近年研究顯示,腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一[1],腎小管上皮細(xì)胞可通過EMT轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF),進(jìn)入間質(zhì),合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM),直接導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)行性發(fā)展。腎小管上皮轉(zhuǎn)分化受多種因素影響,TGF-β1被公認(rèn)為是最重要的誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞因子。TGF-β1作為核心因子,啟動并調(diào)節(jié)EMT的全過程,其誘導(dǎo)EMT的過程也是在病理狀態(tài)下導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要途徑[2]。除此之外,整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK),受體酪氨酸激酶-Ras/絲裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK),RhoA/ROCK等均參與腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、生長、分化、凋亡等過程,以及在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和維持組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要作用[3]。研究表明Wnt信號通路與腎纖維化的形成密切相關(guān),近年來的研究證實(shí)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]。因此深入研究Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用,可為抗腎臟纖維化的治療提供新的可能途徑及干預(yù)靶點(diǎn)。

1 Wnt信號通路

1982年,Nusse和Varmus[5]在用小鼠乳頭瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)誘導(dǎo)小鼠乳腺癌過程中發(fā)現(xiàn)了Wnt基因,由于該基因的激活依賴MM TV的插入(insertion),因此被命名為Int21。隨后的研究證明,Int21與果蠅屬體節(jié)極性基因Wingless為同源基因,因此,又將Wingless與Int21結(jié)合,稱為Wnt基因。

1.1 Wnt信號通路的組成 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路,調(diào)控著機(jī)體的許多生命過程。該通路的主要成分包括Wnt蛋白家族、Frizzled/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(Fz/LRP)、胞質(zhì)內(nèi)的 Dishevelled蛋白(Dsh)、β-環(huán)連蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、支架蛋白(axin/conductin)、結(jié)腸腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)和 T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)轉(zhuǎn)錄因子家族。Wnt是一種富含半胱氨酸殘基的分泌型糖蛋白,在進(jìn)化過程中高度保守,在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá),主要通過自分泌或旁分泌的方式激活膜受體而發(fā)揮作用,Wnt蛋白表達(dá)是Wnt信號通路活化的重要起始信號。目前已知的主要有19種Wnt蛋白,參與 Wnt經(jīng)典信號通路的Wnt蛋白有Wnt1,3a,8等。參與非經(jīng)典信號通路的Wnt蛋白有Wnt4,5a,11等[6]。Fz為 7次跨膜蛋白,其氨基端的配體結(jié)合區(qū)(cysteine rich domain,CRD)富含半胱氨酸,是Wnt信號通路中最主要的受體蛋白。Dsh蛋白是Wnt經(jīng)典信號從膜受體傳遞至胞內(nèi)的中心分子,有3個高度保守的結(jié)構(gòu)域(DIX、DEP、PDZ),Dsh能通過它的DIX結(jié)構(gòu)域和PDZ與DEP結(jié)構(gòu)域之間的一部分序列與axin相互作用。β-catenin是由CTNNB1基因編碼的一種多功能蛋白質(zhì),具有介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩大功能,1980年由德國細(xì)胞生物學(xué)家Walt Birchmeier在研究細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相關(guān)分子時首先發(fā)現(xiàn)的,是Wnt信號通路中有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的關(guān)鍵成員,在細(xì)胞核內(nèi)與Wnt途徑的另一成員TCF/LEF結(jié)合從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。

1.2 Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 目前的研究證實(shí)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為:Wnt經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,也稱 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Wnt非經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前研究比較多、比較深入的一條分支。

當(dāng)經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活后,分泌到胞外的Wnt與跨膜受體Lrp5/Lrp6以及Fz結(jié)合形成復(fù)合物并激活受體,進(jìn)而激活胞內(nèi)的Dsh,導(dǎo)致GSK-3β活性受到抑制使其從axin上脫落,阻止β-catenin降解復(fù)合體(主要由 APC、axin、GSK-3β構(gòu)成)的形成,因此β-catenin也就不會被磷酸化和降解[8]。研究同時發(fā)現(xiàn)β-catenin降解復(fù)合體(如 APC或 axin突變)和β-catenin基因本身突變均可導(dǎo)致β-catenin降解障礙。當(dāng)胞內(nèi)β-catenin達(dá)到一定的水平時,形成游離的β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移,與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體,最終實(shí)現(xiàn)某些特定基因表達(dá)的增強(qiáng)或者減弱?，F(xiàn)有的研究證明[9]該信號通路可以激活 c2myc、周期素D1(cyclin2D1)、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生長因子等,并且不斷有新的靶基因被發(fā)現(xiàn)。在這條信號途徑中β-catenin處于中心位置,其在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量和狀態(tài)對該途徑有決定性影響,因此被認(rèn)為是該信號途徑激活的標(biāo)志[10]。

Wnt非經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又分為Wnt/Ca2+通路和細(xì)胞極性通路(planar cell polarity pathway,PCP)。Wnt/Ca2+通路主要由Wnt5a和Wnt11激活,從而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活,以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著和細(xì)胞運(yùn)動,但其具體的信號傳導(dǎo)機(jī)制還不清楚。細(xì)胞極性通路PCP,其主要通過激活 Dsh下游區(qū)、小 GTP酶、Rho、Rac、Cdc等從而調(diào)節(jié)JNK信號來發(fā)揮作用[11]。該通路主要參與細(xì)胞極性的建立和細(xì)胞骨架重排。

2 Wnt信號通路與腎臟纖維化

2.1 Wnt信號通路相關(guān)蛋白在腎臟纖維化中的表達(dá) 正常機(jī)體腎臟中Wnt信號是“沉默”的[12],胞質(zhì)中僅有少量游離態(tài)的β-catenin,體內(nèi)絕大多數(shù)β-catenin在胞膜處與 E-cadherin形成復(fù)合體,對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的遷移發(fā)揮作用。Surendran等[3]利用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法造成大鼠小管間質(zhì)性腎纖維化模型,發(fā)現(xiàn)Wnt4在集合管中有表達(dá)伴隨集合管周圍纖維化形成,間質(zhì)成纖維細(xì)胞Wnt4高水平表達(dá)與I型膠原mRNA及α-SMA的高表達(dá)一致;體外實(shí)驗(yàn)表明Wnt4可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。Surendran等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腎損傷后腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中βcatenin信號活化,重組的sFRP4蛋白可以抑制成纖維細(xì)胞的分化及其功能,從而抑制腎纖維化的進(jìn)程。Bienz[10]在單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎臟纖維化模型中發(fā)現(xiàn)多種Wnt信號通路及靶基因蛋白Wnt(1,2,2b,3,3a,4,5a,6,7a,7b,8a,9a,16)、FZD(3,10)、 DKK(1,3,4)、Twist、β-catenin、c-Myc、LEF、fibronectin、MMP-7均不同程度的升高。Lin等[13]研究表明在高糖條件下腎小球膜細(xì)胞 Wnt4、Wnt5a、p-GSK-3β、β-catenin 高表達(dá)。閆喆等[14]利用高糖培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞,檢測發(fā)現(xiàn)Wnt4、β-catenin和α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增高,而E-cadherin表達(dá)降低,且Wnt4及胞核β-catenin蛋白表達(dá)與高糖刺激呈時間依賴性。這些說明當(dāng)腎臟纖維化時,Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加,提示W(wǎng)nt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。

2.2 Wnt信號通路在腎臟纖維化中的轉(zhuǎn)導(dǎo) 當(dāng)Wnt通路被激活后,Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的跨膜受體結(jié)合,激活胞漿內(nèi)的散亂蛋白,使β-catenin的降解復(fù)合體:Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物解聚而失活,β-catenin磷酸化受抑制而降解減少,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin大大增加,與轉(zhuǎn)錄因子 T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)家族成員結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體,引起特定的基因增強(qiáng)或減弱,最終促進(jìn)EMT的發(fā)生,目前證實(shí)有Twist、E-cadherin、fibronectin、MM P-7、α-SMA 等重要的與纖維化相關(guān)基因[4,15]。同時,Wnt信號通路與 TGF-β1通路、PI3K/Akt通路和ILK之間有著重要的對話。TGF-β1促進(jìn)Wnt蛋白的分泌,激活 PI3K/Akt通路和 ILK,直接磷酸化GSK-3β并抑制其活性,進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄復(fù)合體β-catenin/TCF以及轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn) EMT[16]。此外,TGF-β1與受體結(jié)合,活化的TGF-β1受體能夠特異地識別和磷酸化 Smad蛋白家庭成員Smad2和Smad3,R-Smads又與其伴侶分子Smad4結(jié)合,形成有功能的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,Smad3、Smad4可以與β-catenin和TCF/LEF結(jié)合,促進(jìn)兩信號間相互作用,引起靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-18]。

3 以Wnt信號通路為靶點(diǎn)的抗纖維化治療

越來越多的研究表明,Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腎臟纖維化密切相關(guān),因Wnt信號途徑最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤的發(fā)生,針對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號分子為靶點(diǎn)的抑制劑已成為抗腫瘤的候選藥物,而這些同樣可能成為于抗腎臟纖維化的治療靶點(diǎn),只是目前仍在研究階段。

3.1 在細(xì)胞外水平阻斷Wnt信號 Wnt配體本身可通過反義寡核苷酸技術(shù)、RNA干擾技術(shù)及中和抗體技術(shù)等成為抗腎臟纖維化治療靶點(diǎn)。Wnt信號分子的拮抗劑,如Wnt信號分子特異性結(jié)合的卷曲相關(guān)蛋白(frizzled-related proteins,FRPs)和DKKs,已成為天然的抗腫瘤藥物。DKK蛋白是Wnt輔助受體LRP5/6的拮抗劑,具有抗腎臟纖維化潛能,在人類中已發(fā)現(xiàn)4種DKK蛋白。Zhu等[19]利用培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的DKK1可明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動能力,并可誘導(dǎo)β-catenin的定位改變及增加細(xì)胞間黏附。Dai等[20]研究發(fā)現(xiàn)DKK1可以明顯抑制阿霉素處理大鼠的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,改善蛋白尿及腎臟纖維化。He等[4]研究發(fā)現(xiàn)DKK1可以顯著的抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎臟β-catenin的堆積,從而抑制α-SMA以及膠原的產(chǎn)生。

3.2 在細(xì)胞質(zhì)水平靶向 Wnt/β-catenin信號 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白的相互作用而受到嚴(yán)密調(diào)控。由于結(jié)腸腺瘤性息肉病基因蛋白APC在結(jié)直腸癌中的核心作用,使針對該蛋白的β-catenin結(jié)合區(qū)域的阻斷劑成為有效抑制腫瘤的物質(zhì)。axin是Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控者,該基因突變是某些腫瘤發(fā)生的重要因素。劉樹立等[21]將 axin基因轉(zhuǎn)染入axin低表達(dá)的肺癌BE1細(xì)胞系,結(jié)果axin的mRNA和蛋白水平均明顯增加,β-catenin蛋白表達(dá)明顯減少,TCF-4的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下降。同時,BE1-axin細(xì)胞的凋亡率增加,增殖和侵襲能力明顯下降。因此,在胞質(zhì)水平加強(qiáng)APC、axin等的表達(dá),可以達(dá)到對過剩β-catenin的降解作用,從而阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),達(dá)到抗纖維化的目的。

3.3 靶向β-catenin蛋白表達(dá)和降解 β-catenin是 Wnt信號通路的關(guān)鍵分子。以往研究表明,在纖維化的過程中都存在βcatenin表達(dá)水平上調(diào),因此靶向β-catenin的治療引起人們的廣泛關(guān)注。目前,反義寡核苷酸技術(shù)、RNA干擾技術(shù)及蛋白敲除技術(shù)處于研究階段。特異性的β-catenin干擾RNA可以減少腫瘤β-catenin蛋白的表達(dá),從而阻斷Wnt信號通路,成為不依賴GSK-3β磷酸化抗腫瘤治療的一個新靶點(diǎn)。Hong等[22]用β-catenin干擾RNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制β-catenin的表達(dá)、胞核分布以及胃癌細(xì)胞的生長。麥玉潔等[23]同樣用β-catenin干擾 RNA轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞Jurkat和K562細(xì)胞,結(jié)果β-catenin的mRNA和蛋白水平均降低,對細(xì)胞的生長有明顯的抑制。然而,目前其在抗腎臟纖維化方面的研究還有待進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3.4 在細(xì)胞核水平靶向 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 βcatenin最終發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)是在其入核同TCF/LEF形成復(fù)合物,增強(qiáng)或抑制特定的靶基因?qū)崿F(xiàn)的。因此,抑制復(fù)合物的形成理所當(dāng)然地成為了抗纖維化治療的又一治療靶點(diǎn)。Lepourcelet等[24]設(shè)計(jì)出用于鑒別抑制 TCF-4與β-catenin相互作用化合物的高通量藥物篩選方法。Wei等[25]應(yīng)用3種TCF-4與β-catenin復(fù)合物拮抗劑 PKF118-310、PKF115-584和 CGP 049090處理肝癌細(xì)胞,可以明顯地抑制c-Myc、cyclin D1和survivin等的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制癌細(xì)胞的生長。

4 結(jié) 語

綜上所述,Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但目前對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路本身及其在腎臟纖維化中的作用機(jī)制尚未完全闡明。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控方式、與其他信號通路間的相互作用、各靶基因激活的作用和意義、參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的各分子的生理作用等均需進(jìn)一步研究證實(shí)。隨著對這條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不斷深入的了解,有望把Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為抗腎臟纖維化治療的一個重要靶點(diǎn)。

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