莖瘤芥（榨菜）黑斑病病原菌生物學(xué)特性

劉紅芳

（長江師范學(xué)院，重慶 涪陵 408100）

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是重慶市的特色農(nóng)業(yè)資源，其加工產(chǎn)品“涪陵榨菜”蜚聲海內(nèi)外。在主產(chǎn)區(qū)涪陵，每年莖瘤芥種植面積約4萬公頃，是該區(qū)農(nóng)民增收的主要經(jīng)濟(jì)來源。危害莖瘤芥的病害主要有病毒病、根腫病、霜霉病和黑斑病等，這些病害嚴(yán)重影響榨菜生產(chǎn)的順利進(jìn)行，成為該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。王旭祎等對(duì)病毒病、根腫病、霜霉病的發(fā)生、防治進(jìn)行了相關(guān)研究[1-2]。但對(duì)莖瘤芥黑斑病的研究，至今未見相關(guān)報(bào)道。自2010年始,筆者對(duì)莖瘤芥黑斑病進(jìn)行了病原菌生物學(xué)特性研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

從重慶市涪陵區(qū)農(nóng)科所采集莖瘤芥黑斑病標(biāo)本,在PDA培養(yǎng)基上用常規(guī)組織分離法獲得純培養(yǎng)后,再按柯赫氏法則接種進(jìn)行致病性測(cè)定,對(duì)再次分離得到的病原菌據(jù)《中國真菌志——鏈格孢屬》進(jìn)行鑒定[2]。

1.2 莖瘤芥黑斑病菌生物學(xué)特性的研究

1.2.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響選用PDA、PSA、玉米粉培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基等5種培養(yǎng)基。取PDA上培養(yǎng)的菌種，分別放于5種培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)，4次重復(fù)，直至生長最快的培養(yǎng)基中菌落直徑接近9 cm時(shí)，用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落生長直徑。

1.2.2 營養(yǎng)生長及孢子形成（1）溫度。PDA培養(yǎng)基接菌后分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培養(yǎng)箱中，每處理4次重復(fù)，直至生長最快的溫度設(shè)置處理中菌落直徑接近9 cm時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。培養(yǎng)10 d后，用直徑7 mm的打孔器在距菌塊中心1 cm處打取菌餅，置于10 mL無菌水中激烈振蕩制成孢子懸浮液,滴4～6滴于載玻片上，在顯微鏡下鏡檢,每滴記5～8個(gè)視野內(nèi)的孢子數(shù)，取其平均值（各處理隨機(jī)抽取，1次重復(fù)）。以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)控制溫度為25℃，生長最快的處理中菌落直徑接近9 cm時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)10 d后測(cè)產(chǎn)孢量（未標(biāo)明處均為3次重復(fù)）。（2）pH值。用磷酸緩沖液將PDA培養(yǎng)基pH值調(diào)配為3、4、5、6、7、8、9、10、11。（3）光照。將接種后的PDA培養(yǎng)基分別置于日光燈下連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗等條件下。（4）碳源利用。在Czapek培養(yǎng)基中分別以等量的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、木糖等與其中的蔗糖（CK）置換。（5）氮源利用。在Czapek培養(yǎng)基中分別以等量的硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氯化銨和硫酸銨等6種氮源與其中的NaNO3（CK）置換。

1.2.3 孢子萌發(fā)（1）溫度。配制孢子懸浮液，分置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培養(yǎng)箱中，于4、8、12、24 h鏡檢孢子萌發(fā)率。以下各條件實(shí)驗(yàn)控制溫度為25℃，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率（未標(biāo)明處均為3次重復(fù)）。。（2）pH值。用磷酸緩沖液將孢子懸浮液pH值調(diào)配為3、4、5、6、7、8、9、10、11，每處理重復(fù)6次。（3）營養(yǎng)。設(shè)莖瘤芥浸漬液、1%葡萄糖液、無菌水等3個(gè)處理。（4）濕度。用濃硫酸在密閉的干燥器中調(diào)節(jié)濕度，自菌落上挑取少許孢子在載玻片上涂勻，將相對(duì)濕度控制在100%、98%、93%、90%、80%、75%、65%、50%。（5）光照。將孢子懸浮液滴一滴于載玻片上，分置于日光燈下連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗等條件下。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

對(duì)病葉進(jìn)行組織分離培養(yǎng)后,將菌株回接到幼嫩的莖瘤芥（榨菜）葉上，均能產(chǎn)生典型的莖瘤芥（榨菜）黑斑病病斑，再次進(jìn)行分離，挑取單孢純化，獲得病原菌。將分離、純化得到的菌株在顯微鏡下觀察,結(jié)果表明，病原菌菌株分生孢子梗單生或數(shù)根束生，暗褐色；分生孢子褐色或青褐色，圓筒形至橢圓形,具一短喙，3～6個(gè)串生，有縱隔膜0～4個(gè)，橫隔膜3～8個(gè)，橫隔處有縊縮現(xiàn)象。根據(jù)真菌分類鑒定，此病原菌為鏈格孢菌[3]。

2.2 莖瘤芥黑斑病菌生物學(xué)特性的研究

2.2.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響在5種不同培養(yǎng)基上，病原菌均能生長，但在PDA和PSA培養(yǎng)基上菌落生長最好，其次為玉米粉、燕麥片和Czapek培養(yǎng)基（圖1）。

圖1 第五天時(shí)五種培養(yǎng)基菌落生長直徑

2.2.2 營養(yǎng)生長及孢子形成（1）溫度。不同溫度下，病原菌的生長有極顯著的差異。病原菌在25～30℃生長最快，為最適生長溫度，25℃最適產(chǎn)孢，低于5℃或高于40℃，菌絲均不能生長（表1）。（2）pH值。病原菌在pH值3～11范圍內(nèi)均可生長，pH值6～8時(shí)生長較好，pH值5～7時(shí)適宜產(chǎn)孢，以pH值6最適（表2）。（3）光照。不同光照處理對(duì)菌絲的生長無顯著影響，但在全光照處理下產(chǎn)孢量最多，其次是光暗交替處理；全黑暗處理產(chǎn)孢量最少，表明光照具有促進(jìn)病原菌產(chǎn)孢的作用（表3）。（4）碳源利用。在不同碳源中，菌絲生長速度存在明顯差異，以麥芽糖最為理想，其次為葡萄糖，木糖最差。在供試的碳源中，病原菌均可產(chǎn)孢，其中以麥芽糖最適，其次為葡萄糖，甘露糖最差（表4）。（5）氮源利用。病原菌對(duì)牛肉膏、蛋白胨和酵母膏的利用效果最好，其次為硝酸鉀和硝酸鈉，氯化銨和硫酸銨的利用最差。在供試的氮源中病原菌均可產(chǎn)孢，其中以牛肉膏、蛋白胨最適，其次為酵母膏，氯化銨最差。這說明病原菌對(duì)有機(jī)態(tài)氮和硝態(tài)氮利用效果好（表5）。

表1 不同溫度對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

表2 不同PH值對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

表3 光照對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

表4 不同碳源對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

表5 不同氮源對(duì)病原菌生長及產(chǎn)孢的影響

2.2.3 孢子萌發(fā)（1）溫度。溫度對(duì)病原菌分生孢子的萌發(fā)率有較大影響。病原菌在10～35℃均能萌發(fā)，20～30℃是萌發(fā)的適宜溫度區(qū)，低于10℃則分生孢子的萌發(fā)受到抑制，40℃條件下未見萌發(fā)（圖2）。（2）pH值。分生孢子在pH值3～11時(shí)均能萌發(fā),在pH值6～7時(shí)24 h萌發(fā)率達(dá)到80%以上,其余均不足50%。pH值為3和11時(shí)，萌發(fā)率較低，24 h僅30%萌發(fā)（圖3）。（3）營養(yǎng)。分生孢子在莖瘤芥葉片浸漬液、1%葡萄糖液和無菌水中均能萌發(fā)。在莖瘤芥葉片浸漬液和1%葡萄糖液中萌發(fā)率均高于無菌水中的萌發(fā)率，但分生孢子的萌發(fā)率差別不大（圖4）。（4）濕度。分生孢子萌發(fā)對(duì)相對(duì)濕度的要求非常嚴(yán)格，RH在90%以上時(shí)孢子才能萌發(fā)，最適RH為98%～100%，當(dāng)RH<90%時(shí)，孢子不能萌發(fā)，當(dāng)RH為100%時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最大值97%（圖5）。（5）光照。通過全光照、12 h光照12 h黑暗和無光照的培養(yǎng),結(jié)果表明:全光照處理孢子萌發(fā)率最高,達(dá)95.6%；其次是光暗交替處理，孢子萌發(fā)率為93.8%；全黑暗處理孢子萌發(fā)率為89.7%，明顯低于前兩者。這表明光照具有促進(jìn)病原菌分生孢子萌發(fā)的作用（圖6）。

圖2 溫度對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

圖3 pH值對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

圖4 營養(yǎng)對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

圖5 濕度對(duì)對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

圖6 光照對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

3 小結(jié)

鏈格孢菌為一類寄主范圍較廣的病原菌,人們對(duì)該類病原菌的生物學(xué)特性研究的較多[4-6]。本文針對(duì)莖瘤芥（榨菜）黑斑病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，確定該病原菌最適生長培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基；最適生長溫度為25～30℃；最適生長pH值為6～8；光照對(duì)病原菌的生長無明顯影響，但在全光照處理下產(chǎn)孢量最多；麥芽糖為最適產(chǎn)孢的理想碳源，病原菌對(duì)有機(jī)態(tài)氮和硝態(tài)氮利用效果較好。分生孢子萌發(fā)的最適溫度為20～30℃，最適pH值為6～7，最適RH為98%～100%，在1%葡萄糖液、水及莖瘤芥（榨菜）葉片浸漬液中萌發(fā)均較好，光照具有促進(jìn)病原菌分生孢子萌發(fā)的作用。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步了解莖瘤芥（榨菜）黑斑病的發(fā)生規(guī)律和病害的防治提供了一定的理論依據(jù)。下一步的工作，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行病情調(diào)查及病害發(fā)生規(guī)律和流行趨勢(shì)的觀察,并對(duì)該病害進(jìn)行藥劑和生防菌的篩選，以便提出綜合防治措施。

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