河南豬株旋毛蟲分子鑒定

王麗娜，路國兵，楊曉東，高 云，陳曉寧

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

河南豬株旋毛蟲分子鑒定

王麗娜，路國兵，楊曉東，高 云，陳曉寧△

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

目的:通過分析河南豬株旋毛蟲18S rRNA基因同源性序列，對旋毛蟲進行分子鑒定及分類。方法:收集旋毛蟲成蟲，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)特異引物擴增獲得18S rRNA基因片段，將此目的基因與 pMD18-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。陽性克隆經(jīng)酶切鑒定后進行序列測定及分析。結(jié)果:河南豬株旋毛蟲與親緣關(guān)系較近蟲株Trichinella nativa(AY487254.1)的同源性達99%。結(jié)論:河南豬株旋毛蟲歸屬于T.nativa。

旋毛蟲；鑒定；18S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育樹

旋毛蟲病(trichinellosis)是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，可感染人及150多種哺乳動物，呈全球性分布，并被列為三大人獸共患寄生蟲病之首(旋毛蟲、囊蟲及棘球蚴）[1]。近年來，旋毛蟲病的流行范圍進一步擴大，發(fā)病率有逐年升高的趨勢[2]。自發(fā)現(xiàn)旋毛蟲以來，毛形屬的分類問題一直被人們所關(guān)注，目前國際上已將毛形屬分為8個隔離種和3個分類地位尚未確定的基因型(T6、T8、T9)[3]。由于旋毛蟲屬種分類復(fù)雜，本研究從分子遺傳的角度分析了河南豬分離株18S rRNA的序列，并進一步探討其歸屬問題。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲來源 旋毛蟲株(河南株）由本教研室小鼠傳代保種。

1.2 實驗動物 健康成年雄性昆明小鼠，20-25g，購自承德醫(yī)學院實驗動物中心。健康成年雄性SD大鼠，180-220g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑 胃蛋白酶(1：3000)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海生物工程技術(shù)有限公司；載體pMD-18T、Tag DNA聚合酶、內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ，大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，英國Oxoid公司；氨芐青霉素，美國Amresco公司；DNA marker，北京泰格美科技有限公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京三博遠志生物技術(shù)有限公司。

1.4 收集旋毛蟲成蟲 處死保種小鼠，分離全身肌肉，搗碎后采用改良貝氏法收集囊包幼蟲。收集到的囊包幼蟲經(jīng)口感染大鼠，8000條/只，第5d處死，取全部小腸，縱向剪開，無菌生理鹽水洗凈，37℃溫箱孵育2h，孵育液

200目紗網(wǎng)過濾，沖洗紗網(wǎng)洗下成蟲，沉淀收集干凈成蟲，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR擴增18S rRNA基因 取旋毛蟲成蟲100mg，Trizol法提取旋毛蟲成蟲總RNA。引物序列為：P1：5′-AAGCTTGCTTGTCTCAAAGATT-3′，P2：5′-GA TCCTTCCGCAGTTCACCTAC-3′，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA， 20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：42℃、15min，95℃、5min，4℃、5min。以該cDNA為模板，按PCR擴增試劑盒說明操作，PCR反應(yīng)體系為50μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。取5μl PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 目的基因分子克隆和鑒定 按試劑盒說明回收電泳后的PCR產(chǎn)物。取適量PCR回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T Vector 16℃連接10h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，在氨芐抗性平板上進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素50μg/ml），37℃搖床振搖(180r/min）培養(yǎng)6h至對數(shù)生長期，菌落PCR鑒定陽性克隆子。按質(zhì)粒小量提取試劑盒說明提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 測定、分析18S rRNA基因序列 將陽性克隆送三博遠志有限公司測序，所得18S rRNA基因序列進行BLAST分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增得到一條約1800bp的條帶，與預(yù)期相符，表明成功擴增目的基因18S rRNA(圖1）。

圖1 18S rRNA基因克隆電泳圖

圖2 菌液PCR鑒定

2.2 PCR法篩選菌落陽性克隆 以篩選得到的陽性克隆菌液為模板，經(jīng)PCR擴增出18S rRNA基因片段，與理論值一致，約1800bp，表明陽性克隆含有18S rRNA基因(圖2）。

2.3 目的基因克隆后酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，預(yù)期產(chǎn)生大小分別約為2700bp和1800bp的兩條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期相符，表明目的基因克隆成功(圖3）。

圖3 酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD18-T-18S rRNA

2.4 18S rRNA基因序列測定及分析 將所測18S rRNA堿基序列對NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST，河南省豬旋毛蟲與毛線蟲屬的同源性最高，與已知蟲株Trichinella nativa(AY487254.1)的同源性可達99%。

3 討論

在旋毛蟲的不同發(fā)育階段，蟲體各階段之間及各地旋毛蟲隔離種之間缺乏一定的規(guī)律性變化，因此旋毛蟲形態(tài)學指標在分類研究中缺乏一定的說服力[4]。近年來同工酶分析、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD）及擴增片段長度多態(tài)性(AFLP）等多種方法應(yīng)用于旋毛蟲的鑒定與分類，但因需要大量蟲體或重復(fù)性較差等因素使它們的應(yīng)用受到了限制。

18S rRNA基因在生物體內(nèi)含量較大，在進化過程中非常保守，核苷酸的替換率較低，在分類學中可作為一個科學可靠的指標。近年來，利用18S rRNA序列變化來探討生物種間和種內(nèi)的親緣關(guān)系，系統(tǒng)進化以及鑒定未知的種屬等問題，已經(jīng)成為一種趨勢[5]。李冬梅等[6]用 18S rRNA序列設(shè)計引物，應(yīng)用PCR方法確定黑龍江株豬旋毛蟲為旋毛形線蟲，犬旋毛蟲為本地毛形線蟲。

本研究18S rRNA基因測序結(jié)果及同源性序列分析發(fā)現(xiàn)，河南豬旋毛蟲與北方旋毛蟲的同源性可達99%，表明河南省豬旋毛蟲歸屬于T2(T.nativa）。但當前的研究發(fā)現(xiàn)，我國的豬源旋毛蟲大多歸屬于T1，犬旋毛蟲則多為T2。La Rosa等[7]對我國5個豬源旋毛蟲地理株進行等位基因酶分析，發(fā)現(xiàn)均為T1；崔晶等[8]應(yīng)用多重PCR技術(shù)鑒定，表明我國6個豬源旋毛蟲地理株均為T1。本研究的鑒定工作豐富了人們對我國豬源旋毛蟲生物多樣性的認識。

隨著分子生物學的興起和發(fā)展，研究者們選用眾多的分子標記物應(yīng)用于物種的系統(tǒng)演化和分類研究，在選用不同的遺傳標記對物種進行分類的過程中，經(jīng)常得出一些與傳統(tǒng)分類學不相符的結(jié)果，甚至截然不同的結(jié)果[9]。我國地域遼闊，不同或者相同的地理區(qū)域旋毛蟲種在遺傳物質(zhì)上既有保守性又有一定的分化。雖然旋毛蟲的分類日益清晰，但物種在不斷進化及變異，還須對一些種屬的分類進行重新評定，做進一步的探索。我國是否還存在旋毛蟲的其它種或基因型，還有待于對更多的旋毛蟲地理株進行鑒定和分類。

[1]王中全，崔晶.旋毛蟲病的診斷與治療[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2008，26(1)：55-57.

[2]溫艷，張月清.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測旋毛蟲DNA的實驗研究[J].中國人獸共患病雜志，2001，17(1)：61-62.

[3]姚春雨，汪明，劉明遠，等.旋毛形線蟲分類的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學，2008，38(01)：82-85.

[4]徐克成，劉明遠，姚春雨.中國八地區(qū)旋毛蟲繁殖力指數(shù)測定的比較[J].中國人獸共患病雜志，1998，14(3)：62-63.

[5]王寶慶，葛菁萍，平文祥.18S rRNA在系統(tǒng)進化研究中的應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥，2005，18(4)：251-252.

[6]冬梅，王秀榮，路義鑫，等.4個旋毛蟲隔離種18S rRNA基因分子克隆及序列比較分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2005，39(4)：860-864.

[7]La Rosa G, Pozio E, Rossi P, et a1.Allozyme analysis of Trichinella isolates from various host species and geographical regions[J]. J Parasitol, 1992, 78(4): 641-646.

[8]崔晶，趙桂花，王中全，等.應(yīng)用多重PCR技術(shù)鑒定我國6個旋毛蟲地理株的研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2008，26(2)：86-89.

[9]任竹梅，馬恩波，郭亞平.山稻蝗及相關(guān)物種Cyt b基因序列及其遺傳關(guān)系[J].遺傳學報，2002，29(6)：507-513.

（基礎(chǔ)醫(yī)學欄目編輯:陳志宏）

MOLECULAR IDENTIFICATION OF SWINE-ORIGINATED TRICHINELLA IN HENAN PROVINCE

WANG Li-na, LU Guo-bing, YANG Xiao-dong, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To identify and classify swine-originated Trichinella in Henan province at molecular level by sequence homology analysis of 18S rRNA gene.Methods:Total RNA was extracted from adult Trichinella and obtained cDNA by reverse transcription. 18S rRNA gene was amplified by specific primer, connected to pMD18-T and transformed colibacillus competent cells. The positive clone was determined sequence and analyzed after restrictive endonuclease digestion.Results:In the phylogenetic tree, swine-originated Trichinella in Henan province had close relationship with Trichinella nativa (AY487254.1) of 99% sequences similarity.Conclusions:Swine-originated Trichinella in Henan province belongs to T.nativa.

Trichinella; Identification; 18S rRNA; Phylogenetic tree

圖分類號】R383.1

A

1004-6879(2011）02-0128-03

2010-12-12）

△ 通訊作者