用化學發(fā)光免疫法檢測有機氯農藥DDTs的殘留量

張峰,倪慧,張斯

(1.大連海洋大學生命科學與技術學院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,遼寧大連116023)

用化學發(fā)光免疫法檢測有機氯農藥DDTs的殘留量

張峰1,2,倪慧1,張斯1

(1.大連海洋大學生命科學與技術學院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,遼寧大連116023)

建立了檢測有機氯農藥DDTs殘留的化學發(fā)光免疫分析技術(chemiluminescence immunoassay, CLIA),以魯米諾和過氧化氫作為化學發(fā)光底物,測定樣品中有機氯農藥DDTs殘留。結果表明:發(fā)光底物液非催化下,5～7 min后發(fā)光值較穩(wěn)定;在發(fā)光底物液酶催化下,反應10 min接近峰值;DDTs標準曲線線性范圍為0.05～25 ng/mL,標準樣品DDTs濃度與發(fā)光值呈現(xiàn)很好的線性相關,線性方程為y=-63.806x +13426,R2=0.9945,檢測最低限為0.05 ng/mL;回收率為91.4%～107.8%。

有機氯農藥;DDTs殘留;化學發(fā)光免疫分析

目前滴滴涕(DDT)及異構體的殘留分析主要采用氣相色譜法[1-2]。該方法靈敏度高,但也存在一些不足,如儀器化程度高且價格昂貴,分析速度慢,需專業(yè)技術人員,不適合在基層推廣。余霞奎等[3]應用氣相色譜法對水產品中有機氯農藥殘留進行檢測,結果表明,最低檢出限分別為: o,p'-DDT 2.7 μg/kg,p,p'-DDT 4.0 μg/kg,p, p'-DDD 1.6 μg/kg,p,p'-DDE 0.5 μg/kg?；瘜W發(fā)光法由于不需要外來光源,避免了瑞利散射和拉曼散射等噪聲的影響,大大提高了信噪比[4]。該方法具有靈敏性高、線性范圍寬、儀器簡單、操作簡便等特點,已廣泛用于環(huán)境、臨床、食品和工業(yè)分析中。董玉華等[5]應用酶聯(lián)免疫吸附法分析了海水和貝類中的DDT及代謝物,最低檢出限分別為:DDT 25 ng/mL,DDA 1.56 ng/mL,DDD 25 ng/mL,DDE 25 ng/mL。1977年Arakawa等[6]基于放射免疫分析原理,將酶的化學發(fā)光和免疫反應結合起來,建立了化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)法。該方法將發(fā)光物質或酶標記在抗原或抗體上,免疫反應結束后,加入氧化劑或酶底物而發(fā)光,通過測定光強度,根據(jù)標準曲線測定待測物的濃度。CLIA的優(yōu)點是靈敏度高,線性范圍寬,標記物的有效期長,無放射性危害,可實現(xiàn)全自動化等。2005年Lin等[7]采用化學發(fā)光免疫分析法檢測氯霉素,最低檢出限為0.046 ng/mL。本試驗中,作者初步采用化學發(fā)光免疫分析法檢測DDTs,以期為檢測水產品中DDTs殘留量提供更簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑魯米諾(luminuol,BioBasic Inc.)和過氧化氫由上海遠大氧化物有限公司生產。美國Abraxis公司提供的DDTs ELISA檢測試劑盒中包含本試驗所用包被羊抗鼠抗體96孔板、單克隆鼠抗DDTs抗體(此抗體的抗原為o,p'-DDT、p,p'-DDT和p,p'-DDE,因此本試驗中檢測結果為3種異構體的混合物)、HRP-DDTs標記復合物、DDTs標準品(含有o,p'-DDT、p,p'-DDT和p,p'-DDE,原始濃度為5 μg/mL,介質為甲醇)及標準品稀釋液、洗液。其它藥品均購自上海生工生物有限公司。

化學發(fā)光免疫分析儀由北京亞東亞機械電子技術研究所研制;MK3型酶標儀由上海熱點儀器有限公司生產;WZ-A微量振蕩器由常州澳華儀器有限公司生產;PHS-3C型數(shù)字酸度計購自江蘇江分電分析儀器有限公司;100～1 000 μL移液器、40～200 μL移液器、0.5～10 μL移液器均購自上海儀器有限公司;恒溫水浴鍋、旋轉蒸發(fā)儀由上海亞榮生化儀器廠生產。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)光底物液的制備 底物液為魯米諾和H2O2的混合液(1∶1)[8-10]。魯米諾和H2O2在沒有HRP催化時也能緩慢自行發(fā)光,而在光強度測定中造成空白干擾,需分別配制。稱取0.0886 g魯米諾定容于100 mL碳酸鹽緩沖液(pH為10)中,得到5×10-3mol/L的原液,避光保存于2～8℃下備用,使用前用0.1 mol/L NaHCO3稀釋成5× 10-4mol/L。體積分數(shù)為30%的H2O2臨用前用0.1 mol/L Tris-HCl(pH為8.5)稀釋成5×10-3mol/L備用。

1.2.2 樣品處理 取旅順養(yǎng)殖海參成參體壁,用高速組織搗碎機搗碎,稱取20.0 g置于150 mL錐形瓶中,加入高氯酸-冰乙酸(1∶1)40 mL,在瓶口放一小漏斗,置于80℃水浴中,不停地搖動(為防止產生碳粒,開始時要連續(xù)搖動幾分鐘)至內容物全部消化為止。取下錐形瓶,將消化液移入250 mL分液漏斗中,用40 mL溫蒸餾水沖洗錐形瓶,將洗液并入分液漏斗中。加40 mL石油醚(重蒸餾,65～75℃)振蕩1 min,靜止分層后,將水層放入另一40 mL分液漏斗內,加20 mL石油醚并分離,再用20 mL石油醚提取一次。合并提取液,然后加入無水硫酸鈉水溶液80 mL,振蕩0.5 min,靜止分層后,棄去水層。

向提取液中加入濃硫酸(φ(提取液)∶(φ濃硫酸)=10∶1),輕輕振搖,注意打開活塞放氣,然后劇烈振搖0.5 min,靜止分層,棄去酸層。再按上述操作重復凈化2～3次(凈化至下層酸呈無色或淡黃色),靜止分層后,棄去酸層。加80 mL硫酸鈉水溶液,振搖1 min,靜止分層,棄去水層。加2～4 g無水硫酸鈉于分液漏斗內,輕輕搖動幾次,然后將石油醚通過無水硫酸鈉柱(筒形漏斗中內裝5 cm高的無水硫酸鈉),收集溶液用旋轉蒸發(fā)器濃縮至1 mL,然后用Tris-HCl緩沖液定容至20 mL,用于化學發(fā)光酶免疫分析。計算公式為

式中:c為樣品中所含DDTs的濃度(ng/g);m為樣品質量(g);V為濃縮后體積(mL);y為用化學發(fā)光酶免疫分析得到的發(fā)光值帶入標準曲線方程中計算出的濃度。

1.2.3 發(fā)光底物液非催化發(fā)光 將發(fā)光底物液加入空白孔中,在不同的時間測定其發(fā)光值。

1.2.4 發(fā)光底物液催化發(fā)光 將發(fā)光底物液加入含有辣根過氧化物酶的孔中,反應不同時間后測定其發(fā)光值。

1.2.5 DDTs標準曲線 試驗步驟如下:1)用Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)將DDTs標準品稀釋為0、0.05、0.1、0.5、0.625、1.25、2.5、5、10、25 ng/mL 10個濃度梯度。2)每孔加入50 μL單克隆鼠抗DDTs抗體,用單道槍加樣,輕輕振蕩30 s使孔中溶液混勻,將板裝入袋中封口,避免水蒸氣和紫外線的照射。在室溫(19～25℃)下孵育30 min,然后重復洗板3次,拍板,去掉殘留的洗液。3)吸取25 μL不同濃度的DDTs標準溶液加到對應的包被有羊抗鼠抗體微孔中。每個樣品設兩個對照。4)同時每孔中加入50 μL HRP-DDTs標記復合物,在旋轉器上混勻,在室溫下孵育30 min。重復洗板3次,拍板,去掉殘留的洗液。5)每孔中加入100 μL發(fā)光底物液,在化學發(fā)光儀上讀取發(fā)光強度發(fā)光值,以相對發(fā)光強度(relative light intensity,RLU)的形式表示。

根據(jù)結果建立標準曲線,分析試驗數(shù)據(jù)?？瞻讓φ?除不加標準品外,其它按以上步驟操作。

1.2.6 加標回收率 取兩份相同的樣品,其中一份加入定量的待測成分標準物質,按相同方法分析。加標回收率=(加標試樣測定值-試樣測定值)/加標量×100%。

取實驗室養(yǎng)殖幼參若干和成參10頭(平均體重為100 g±5 g),去內臟,用高速組織搗碎機搗碎,準確稱樣品20 g,分別加入5、10、25 ng/mL的DDT標準品25 μL,混勻后按照上述方法測定,同時將未加入DDTs標準品的樣品作為空白對照,將分析結果與理論回收值進行對比,計算回收率。

1.2.7 驗證化學發(fā)光免疫分析法 為了驗證本試驗中建立的化學發(fā)光免疫分析法的可行性,用Abraxis公司DDTs酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與本試驗中建立的化學發(fā)光酶免疫檢測DDTs進行對比。應用Abraxis公司提供的DDTs酶聯(lián)免疫檢測試劑盒建立標準曲線,并進行加標回收率測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 13統(tǒng)計軟件進行均數(shù)、標準差、組內變異系數(shù)的分析,組間顯著性方差分析采用F檢驗。

2 結果

2.1 發(fā)光底物液非催化發(fā)光和催化發(fā)光

從圖1可見,發(fā)光強度隨時間的延長而降低,

在5～7 min內發(fā)光值變化差異很小。

圖1 發(fā)光底物液非催化發(fā)光Fig.1 The uncatalyzed chemiluminescence values of the substrate

將底物液分別加入不同濃度(0.625、1.25、2.5、5、10、25 ng/mL)的50 μL辣根過氧化物酶孔中,測定其發(fā)光值,結果見圖2。從圖2可見,發(fā)光強度隨時間的變化而增強,10 min后接近峰值,之后開始下降。

圖2 發(fā)光底物液催化發(fā)光Fig.2 The catalyzed chemiluminescence values of the substrate

2.2 DDTs標準曲線

從圖3可見,標準樣品DDTs濃度為0.05～25 ng/mL時呈線性相關,方程為y=-63.806x+ 13426,R2=0.9945。檢測的最低限為0.05 ng/mL。

圖3 DDTs標準曲線Fig.3 The standard curve of DDTs solution

2.3 組內變異系數(shù)及組內、組間的方差分析

從表1可見,不同濃度發(fā)光值變異系數(shù)均小于2%,表明測定結果的重復性穩(wěn)定。從表2可見,組內差異不顯著,組間存在顯著差異。對不同濃度標準品發(fā)光值進行多重比較(LSD法)見表3。結果表明,采用化學發(fā)光酶免疫法檢測DDTs,穩(wěn)定性較好。

表1 標準樣品組內變異系數(shù)及方差分析Tab.1 Coefficient of variation and standard deviation of the standard sampleng/mL

表2 不同濃度標準品發(fā)光值的方差分析表Tab.2 The analysis of vaiance standard samples with different concentrations

2.4 加標回收率

對幼參的檢測結果表明,發(fā)光平均值為13 438。將該值帶入標準曲線的線性方程,得出其體內未有DDTs殘留檢出;成參的發(fā)光平均值為13 348,依據(jù)標準曲線的線性方程得出其濃度為1.22 ng/mL。對加標回收率測定結果見表4,結果顯示,回收率為91.4%～107.8%。

表3 不同濃度標準品發(fā)光值的多重比較(LSD法)Tab.3 The multiple comparisons of standard sample with different concentrations

表4 DDTs的回收率(n=3)Tab.4 The recovery rate of DDTsng/mL

2.5 化學發(fā)光免疫法的驗證結果

為了驗證本試驗中建立的化學發(fā)光免疫分析法的準確性,應用Abraxis公司提供的DDTs酶聯(lián)免疫檢測試劑盒建立ELISA法標準曲線,結果見圖4。從圖4可見,標準樣品DDTs濃度為1.25～10 ng/mL時具有很好的線性相關,線性方程為y= -5.5425x+102.85,R2=0.9828。從圖5可見,標準樣品DDTs濃度為0.625～25 ng/mL時,線性相關性不佳,線性方程為y=～2.3928x+92.255,R2=0.7839。本試驗中應用ELISA法建立的標準曲線的檢測范圍為1.25～10 ng/mL。

圖4 ELISA法DDTs(1.25～10 ng/mL)標準曲線Fig.4 The standard curve of DDTs(1.25～10 ng/ mL)by ELISA

圖5 ELISA法DDTs(0.625～25 ng/mL)標準曲線Fig.5 The standard curve of DDTs(0.625～25 ng/mL)by ELISA

應用ELISA方法對DDTs加標回收率進行測定,結果表明,當DDTs添加濃度為5、10 ng/mL時,回收率分別為94.6%和108.4%。

3 討論

本試驗中,為了保證采用化學發(fā)光免疫法檢測樣品中DDTs含量的準確性和穩(wěn)定性,對發(fā)光底物液進行了最佳條件優(yōu)化。發(fā)光底物液非催化發(fā)光檢測結果證實,5～7 min內化學發(fā)光相對穩(wěn)定,相對誤差小于3%,能滿足檢測要求。不同濃度辣根過氧化物酶催化發(fā)光底物液時,且反應時間為10 min時,發(fā)光值穩(wěn)定,這與梁雁等[11]的結果一致。

本試驗中建立的化學發(fā)光免疫法檢測DDTs標準曲線在0.05～25 ng/mL范圍內呈線性相關,批內變異系數(shù)小于2%,組間差異顯著。目前國內也將化學發(fā)光免疫法用于獸藥殘留檢測。如高彬文等[12]采用化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測魚蝦中氯霉素的殘留量,檢測靈敏度達0.01 μg/kg,檢測范圍為(0.03～23.70)μg/kg,批內變異系數(shù)為7.8%,批間變異系數(shù)為13%。

為了驗證本試驗中建立的化學發(fā)光免疫法對檢測DDTs的可行性,分別用化學發(fā)光免疫分析法與酶聯(lián)免疫分析法對樣品實際測定的加標回收率進行分析。結果表明:用化學發(fā)光免疫分析法測定樣品的回收率為91.4%～107.8%,其標準曲線在0.05～25 ng/mL范圍內呈線性相關;用酶聯(lián)免疫分析法測定的加標回收率為94.6%和108.8%,其標準曲線在0.625～25 ng/mL范圍內呈線性相關(R2= 0.7839),在1.25～10 ng/mL時具有很好的線性相關(R2=0.9828)。應用ELISA法檢測DDTs的線性范圍(1.25～10 ng/mL)小于化學發(fā)光免疫檢測法檢測DDTs的線性范圍(0.05～25 ng/mL),表明采用化學發(fā)光免疫法檢測DDTs時,其靈敏度更高,檢測范圍更寬。

GB 18421-2001中以海洋貝類(雙殼類)為環(huán)境監(jiān)測生物,規(guī)定各類具有使用功能的海洋生物中DDT含量(4種異構體的總和)≤0.01 μg/g。歐盟對進口水產品中DDTs最大殘留限量標準為0.08 μg/mL,日本為0.02 μg/mL,韓國為0.16 μg/mL。用化學發(fā)光酶免疫法檢測DDTs殘留的檢測最低限(0.05 ng/mL)高于各國的最大限量標準。因此,本試驗中建立的化學發(fā)光免疫法檢測DDTs殘留技術可以滿足當前對DDTs最大殘留限量的要求。

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Chemiluminescence immunoassay of organochlorine pesticides DDTs residues

ZHANG Feng1,2,NI Hui1,ZHANG Si1
(1.School of Life Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resoursce Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The chemiluminescence immunoassay(CLIA)method,luminol as CLIA substrate and H2O2as oxidant of luminal,was established for detection of organochlorine pesticides DDTs residues.The results showed that luminescence substrate solution had low and constant luminescence values in 5-7 minutes under uncatalyzed condition, and the peak of the luminescence substrate solution was observed in 10 minutes under catalyzed condition and then the luminescence values began to decrease.The standard curve was found to be linear from 0.05 ng/mL to 25 ng/mL,and linear equation was expressed as y=-63.806x+13426,R2=0.9945,with the minimal detection limit of 0.05 ng/mL,and the recovery varying from 91.4%to 107.8%.

organochlorine pesticides;DDTs residues;chemiluminescence immunoassay

2095-1388(2011)01-0030-05

TS207.5

A

2010-03-15

國家自然科學基金資助項目(3047132)

張峰(1957-),男,教授。E-mail:zhangfeng@dlou.edu.cn