光譜法研究楊梅酮與黃嘌呤氧化酶相互作用

梁啟超，沈廣志，魏 濤，武冬梅

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011; 3.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

黃嘌呤氧化酶(XO)是一種黃素蛋白酶，存在于各種生物體中，可催化體內(nèi)的嘌呤底物形成尿酸［1］.黃嘌呤氧化酶，XO抑制劑通過抑制體內(nèi)XO的活性而減少尿酸生成，對高尿酸血癥和痛風(fēng)產(chǎn)生良好的防治效果，對缺血再灌注損傷、心功能衰竭、內(nèi)皮損傷具有較好的保護(hù)作用［2］，有可能成為治療心血管系統(tǒng)疾病尤其是心衰的藥物.XO由兩個(gè)催化活性互不依賴的、相同的亞單位組成，每個(gè)亞單位各含一個(gè)活性中心，每個(gè)活性中心包括四個(gè)活性輔助基團(tuán):一個(gè)黃素核苷酸輔基(FAD)，兩個(gè)Fe/S，一個(gè)鉬輔因子，鉬輔因子為底物的結(jié)合部位［3］.

楊梅酮(3，5，7，3'，4'，5'－六羥基黃酮)又名楊梅素，屬六羥基黃酮類化合物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示.具有極高的抗氧化和清除自由基的活性［4－5］，此外，有研究表明楊梅素還具有降血糖、降血脂和保肝護(hù)肝等多種生物活性［6］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品［7］.雖然，國內(nèi)外對于黃酮類作為XO抑制劑，通過測量其體外抑酶活性試驗(yàn)IC50值，評價(jià)其構(gòu)效關(guān)系中涉及到楊梅酮［8］，但涉及兩者作用的光譜性質(zhì)還未見報(bào)道.本文利用紫外光譜法研究楊梅酮與XO之間的相互作用，闡明了它們之間的作用的特點(diǎn)，并為XO抑制劑的篩選研究提供一種簡便經(jīng)濟(jì)、直觀可行方法.

圖1 楊梅酮化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV757CRT型紫外－可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)，吸收池厚度為1 cm;F－A2004電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);PB－20標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(德國塞多利斯).

楊梅酮(Sigma公司)用無水乙醇配成1×10－3mol/L儲備液;黃嘌呤氧化酶(Sigma公司)蛋白質(zhì)量濃度53 g/L，酶活性0.67 u/mg(蛋白)，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化，4℃保存?zhèn)溆?PBS緩沖溶液(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO44.3 mmol/L、KH2PO41.4 mmol/L)pH值為7.4.所用試劑均為分析純，溶液用二次蒸餾水配置.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)時(shí)先取3 mL PBS緩沖溶劑加入到標(biāo)準(zhǔn)比色杯中，進(jìn)行基線校準(zhǔn)，消除溶劑對吸光度的影響，再取適量的楊梅酮儲備液加入比色池中，再用pH值為7.4 PBS緩沖溶液稀釋之5×10－5mol/L.測量200～800 nm紫外吸收圖譜.然后將5 μL的黃嘌呤氧化酶加入比色池中(終濃度為60 u/L)，再測量楊梅酮與黃嘌呤氧化酶相互作用不同時(shí)間的紫外光譜及吸光度值.實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

對于大多數(shù)黃酮類化合物來說，紫外光譜主要有兩個(gè)吸收峰，其中之一出現(xiàn)在240～280 nm范圍內(nèi)，是峰帶Ⅱ苯甲酰系統(tǒng)引起的;另一個(gè)在300～ 400 nm范圍內(nèi)，是峰帶Ⅰ桂皮酰系統(tǒng)引起的.黃嘌呤氧化酶含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等氨基酸殘基，這些氨基酸都具有特殊的光學(xué)活性.

楊梅酮先通過疏水鍵向XO表面靠近，進(jìn)入疏水袋，然后發(fā)生并與鉬輔因子螯合，進(jìn)而被XO催化氧化［9－10］，這是目前最完善的楊梅酮－XO反應(yīng)機(jī)理.黃酮類化合物絡(luò)合金屬離子同時(shí)將其從高價(jià)態(tài)還原至低價(jià)態(tài)，還會使含這些離子的金屬酶活性受到抑制，這可能也是黃酮與XO之一［11－12］.

圖2是楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時(shí)間的紫外吸收光譜的變化圖.從圖2中看到，在pH值為7.4的PBS緩沖液中，黃嘌呤氧化酶在278 nm處有最大吸收峰(a);楊梅酮的紫外光譜主要有兩個(gè)吸收峰帶(b)，最大吸收峰分別為峰帶的Ⅰ376 nm和峰帶Ⅱ的266 nm處;圖2中d到j(luò)楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時(shí)間的紫外吸收光譜的變化圖.為當(dāng)楊梅酮與黃嘌呤氧化酶溶液迅速混合后，376 nm處的吸光度在開始的5 min內(nèi)隨時(shí)間迅速下降，發(fā)生明顯的減色效應(yīng)，吸光值從0.923減小到0.552，吸光度下降了約40%，在5 min到29 min期間，吸光度隨時(shí)間緩慢下降到0.323.這說明楊梅酮的峰帶Ⅰ桂皮酰系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，多酚環(huán)被黃嘌呤氧化酶氧化，C2═C3也同樣被氧化，因此由于共軛體系縮短，以及助色團(tuán)的減小，這些造成最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移;同樣，楊梅酮的266 nm處，也發(fā)生顯著的減色效應(yīng)，吸光值從1.173減小到0.808(0～29 min)，吸光度下降了約31%，這說明楊梅酮的峰帶Ⅱ苯甲酰系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;與此同時(shí)，在331 nm處隨時(shí)間逐步出現(xiàn)一個(gè)新的最大吸收峰，其吸光值逐步增大，吸光值從0.649增大到1.053(0～29 min)，這一吸收峰應(yīng)為醌類的吸收特征峰.

圖2 是楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時(shí)間的紫外吸收光譜的變化圖

圖3為楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時(shí)間在376 nm(■)、331 nm(●)和266 nm(▲)三處的紫外吸收光譜的變化圖(5～29 min).三處分方程別為Y=0.584 67－0.009 17X、Y=0.698 86+0.012 24X和Y=1.022 37－0.007 05X，根據(jù)斜率可知它們的k值分別為－9.17×10－4/min、1.224×10－3和－7.05×10－4/min.因此，楊梅酮與黃嘌呤氧化酶為勻速反應(yīng)，楊梅酮是黃嘌呤氧化酶的“自殺性”底物，這表明其反應(yīng)速度是受黃嘌呤氧化酶量限制.

圖3 楊梅酮－黃嘌呤氧化酶復(fù)合體在376 nm、331 nm和272 nm處時(shí)間對吸光值圖

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