芪丑湯對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠EMT抵抗作用研究

張 翠，張 蘭，劉 穎，王曉泊，王 萌，代百東

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitial fibrosis)是各種炎癥和非炎癥腎臟疾病進(jìn)展的最終結(jié)局.近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人類(lèi)慢性腎小球疾病中發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞與腎間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展關(guān)系密切，其標(biāo)志蛋白α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－smooth muscleactin，α－SMA).肌成纖維細(xì)胞可分泌細(xì)胞外基質(zhì):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)腎小球疾病研究中證實(shí)，肌成纖維細(xì)胞可分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白等［1］，腎間質(zhì) α－SMA表達(dá)程度與Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān).

腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用致纖維化細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成－降解失衡及大量積聚等因素在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用.芪丑湯為自擬方，在對(duì)腎大部切除大鼠致慢性腎衰模型的研究中發(fā)現(xiàn)它可減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的程度［1］，本研究目的旨在從分子水平探討芪丑湯對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重(190±20)g，由黑龍江省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)為:黑動(dòng)字第06－4－21號(hào).

1.2 藥物組成

黃芪50 g，大黃10 g，石菖蒲15 g，牽牛子20 g，附子10g，人參15 g，白術(shù)15 g，丹參20 g，王不留行15 g，橘皮10 g組成，以上藥物均購(gòu)自哈爾濱寶豐藥業(yè)有限公司.

1.3 藥液制備

按照各藥在方中的比例準(zhǔn)確稱(chēng)取，混勻，過(guò)濾，制備芪丑湯水煎液的濃縮液，質(zhì)量濃度為每毫升濃縮液含芪丑湯 1.33 g 生藥［2－3］(由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室制備)，4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4 對(duì)照藥

依那普利，揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):05091202，國(guó)藥準(zhǔn)字:H32026567.

1.5 試劑

小鼠抗大鼠α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)單克隆抗體，批號(hào):BM0002.兔抗大鼠膠原蛋白Ⅲ(ColⅢ)多克隆抗體，批號(hào):BA0326.第二抗體為生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG抗體及山羊抗兔IgG抗體，二乙酯焦碳酸(DEPC)，均由博士德生物工程有限公司提供.二氨基聯(lián)苯胺DAB顯色劑，北京中山生物技術(shù)公司提供.肌酐測(cè)定試劑盒，批號(hào):060321;尿素測(cè)定試劑盒，批號(hào):060151;總膽固醇測(cè)定試劑盒，批號(hào):060211;甘油三酯試劑盒，批號(hào):060721.均由北京中生生物工程高技術(shù)公司提供.

1.6 儀器

醫(yī)學(xué)病理圖象分析系統(tǒng):HJPIAS－1000，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供.病理組織漂烘儀:PHY－III，常州中威電子儀器廠提供.電熱鼓風(fēng)干燥箱:DGX－9143P－1，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.生物組織包埋機(jī):BM－VⅡ，孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司.全自動(dòng)生化分析儀:LISA 300 plus型，法國(guó)生產(chǎn).

血液細(xì)胞分析儀:XF9030B型，南京普朗設(shè)備有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制作

模型制作參見(jiàn)薛痕等報(bào)道［4］，采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法.取雄性Wistar大鼠48只，體重(190±20)g，用10%水合氯醛35mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉后局部剪毛.選擇腹正中線切口，依次切開(kāi)皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將左側(cè)輸尿管用止血鉗托起中段部位，夾住，在止血鉗兩側(cè)用4－0號(hào)絲線兩次結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段，兩結(jié)扎點(diǎn)之間剪斷輸尿管，逐層縫合皮下組織及皮膚.假手術(shù)組切開(kāi)皮膚至腹腔，分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎及剪斷輸尿管.手術(shù)后各鼠均腹腔注射青霉素72萬(wàn)單位/kg，連續(xù)3 d以防感染.

2.2 分組與給藥

術(shù)后將大鼠隨機(jī)分為以下6組，假手術(shù)組和模型組各7只，給予等體積生理鹽水;依那普利組9只，給藥劑量為0.77 g/(kg·d－1);芪丑湯高劑量組8只，給藥劑量為26.6 g/(kg·d－1);芪丑湯中劑量組9只，給藥劑量為13.3g/(kg·d－1);芪丑湯低劑量組8只，給藥劑量為6.65g/(kg·d－1).各組灌胃給藥，每日服藥1次，連續(xù)12 d.

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 對(duì)腎組織病理形態(tài)的影響

腎組織縱切4%多聚甲醛固定(含有1/1000DEPC)常規(guī)脫水、浸蠟 、包埋切成2 μm的切片，片行蘇木素(Hematoxylin)—伊紅(Eosin)染色法.雙盲法于光鏡200倍下分別于左上、左下、右上、右下、中間各取2個(gè)視野，每張切片共10個(gè)視野，進(jìn)行半定量分析，依據(jù)文獻(xiàn)［5］結(jié)合本模型特點(diǎn)，選取間質(zhì)纖維化、小管萎縮、間質(zhì)浸潤(rùn)、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、小管擴(kuò)張、小管細(xì)胞空泡變性8項(xiàng)指標(biāo)來(lái)判斷腎間質(zhì)病理改變，每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)定(0=正常，1=輕度受損，2=中度受損，3=重度受損).

2.3.2 VG 染色

常規(guī)脫蠟水洗，采用Weigert氏鐵蘇木精染核5～15min，自來(lái)水充分沖洗，鏡檢核著色程度，蒸餾水洗后以VG染液染l～5min，最長(zhǎng)不超過(guò)7min.直接用新鮮的95%酒精急速分化兼脫水，需數(shù)秒鐘，無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封固.膠原纖維呈深粉紅色.采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，通過(guò)深粉紅色調(diào)節(jié)區(qū)分視野內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)面積，計(jì)算陽(yáng)性目標(biāo)面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2.3.3 血清 Scr、BUN、CHO、TG 檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定.

2.3.4 紅細(xì)胞(RBC)，血紅蛋白(Hb)檢測(cè)

采用電阻抗法和光電比色法測(cè)量紅細(xì)胞和血紅蛋白的含量.

2.3.5 α－SMA、ColⅢ測(cè)定

采用免疫組化SP法檢測(cè):腎組織石蠟切片脫蠟至水，二甲苯三次10min 1次，100%，90%，80%乙醇10min 1次.滴加蒸餾水新鮮配置的0.3%H2O2，溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗(每次5min，共3次)，在微波緩沖液中微波修復(fù)10min.滴加非免疫性驢血清封閉液(含10%驢血清)，室溫下10min.滴加工作質(zhì)量濃度的第一抗體(小鼠抗大鼠α－SMA單克隆抗體，兔抗大鼠LN多克隆抗體，兔抗大鼠ColⅢ多克隆抗體)4℃過(guò)夜.0.1 mol PBS液洗3次;每次3min.加入二抗(生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體及抗兔IgG抗體)37℃孵育30min，0.1 mol PBS液洗3次，每次3min.滴加鏈霉卵白素－堿磷酶軛合物37℃孵育40min，用DAB顯色液顯色3～5min，蘇木素復(fù)染3min，切片經(jīng)梯度脫水干燥、二甲苯透明、用樹(shù)脂封片.每組均以PBS代替第一抗體作陰性對(duì)照.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單盲法評(píng)價(jià).借助HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，測(cè)定腎間質(zhì)陽(yáng)性面積和小管間質(zhì)總面積的比值，進(jìn)行免疫組化半定量分析后取均值.

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

術(shù)后12d模型組左側(cè)腎臟體積較對(duì)側(cè)明顯增大，鏡下見(jiàn)皮髓質(zhì)明顯變薄，以髓質(zhì)為重，可見(jiàn)腎小管排列紊亂，彌漫的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型、多數(shù)腎小管擴(kuò)張、灶狀萎縮，偶見(jiàn)壞死，腎間質(zhì)增寬，有散在或多灶狀單核、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化，腎小球改變不明顯.假手術(shù)組腎間質(zhì)損傷指數(shù)為(0.83±0.23)，模型組(10.71 ±1.13)，依那普利組(8.51 ±1.06)，高劑量組(6.62 ±1.54)，中劑量組(4.93±0.97)，低劑量組(5.85 ±2.03)，模型組與假手術(shù)組比較，病理變化有顯著性差異(P＜0.01)，表明單側(cè)輸尿管梗阻后大鼠腎組織呈現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化樣改變.各治療組與模型組相比，均可使病理變化降低(P＜0.05)，芪丑湯中劑量組與依那普利組比較具有明顯的差異性(P＜0.05)，表明芪丑湯具有減輕腎小管上皮細(xì)胞壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕腎間質(zhì)纖維化作用.

3.2 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織VG染色與膠原分布的影響

采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算陽(yáng)性目標(biāo)面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值.假手術(shù)組陽(yáng)性信號(hào)面積為(4.33 ±1.33)，模型組(33.81 ±6.13)，依那普利組(23.51 ±2.91)，高劑量組(18.77 ±2.24)，中劑量組(15.93 ±2.57)，低劑量組(24.25 ±3.03).模型組與假手術(shù)組比較，陽(yáng)性信號(hào)面積比有顯著性差異(P＜0.01)，表明單側(cè)輸尿管梗阻后大鼠腎組織膠原分布含量升高.各治療組與模型組比較，均可使陽(yáng)性信號(hào)面積比明顯降低(P＜0.05)，芪丑湯中劑量組與依那普利組比較具有明顯的差異性(P＜0.05).

3.3 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)的影響

圖1、2結(jié)果表明:模型組與假手術(shù)組比較差異非常顯著(P＜0.01)，說(shuō)明大鼠單側(cè)輸尿管梗阻后可使BUN、Scr明顯升高;各給藥組同模型對(duì)照組相比，均可使 BUN、Scr明顯降低(P ＜0.05).芪丑湯中劑量組同依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

圖1 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清Scr的影響)

圖2 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清BUN的影響()

3.4 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)的影響

圖3、4結(jié)果表明:模型組與假手術(shù)組比較血清CHO、TG明顯升高(P＜0.01);各給藥組與模型對(duì)照組相比均可使CHO、TG明顯降低(P＜0.01).芪丑湯中劑量組與依那普利組比較有的差異性(P＜0.05).

圖3 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清CHO影響()

圖4 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠血清TG的影響()

3.5 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠RBC、Hb的影響

從圖5、6結(jié)果看出:模型組與假手術(shù)組比較，RBC、Hb明顯降低(P＜0.01)，表明大鼠單側(cè)輸尿管梗阻后可使RBC、Hb濃度降低.各治療組與模型組比較，可使 RBC、Hb明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);中劑量組與依那普利組比較，RBC、Hb有明顯的差異性(P＜0.05);表明芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠引起的RBC、Hb濃度降低具有明顯的升高作用，并且作用強(qiáng)度強(qiáng)于依那普利陽(yáng)性組，且以中劑量作用為最佳(P＜0.05).

3.6 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、ColⅢ表達(dá)的影響

圖5 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠RBC的影響()

圖6 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠Hb的影響()

表1結(jié)果表明:模型組與假手術(shù)組比較，大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ的表達(dá)有顯著性差異(P＜0.01);各給藥組與模型組比較，均可使α－SMA、ColⅢ的表達(dá)明顯降低(P＜0.01).芪丑湯中劑量組與依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

表1 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ表達(dá)的影響()

表1 芪丑湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA、COlⅢ表達(dá)的影響()

4 討論

近來(lái)國(guó)外的研究表明:腎小管上皮細(xì)胞－肌纖維母細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，在人類(lèi)腎間質(zhì)纖維化相關(guān)的腎臟疾病和動(dòng)物模型中扮演了重要角色.α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－ smooth muscular actin，α－SMA)，已被公認(rèn)為肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，用免疫組織化學(xué)的方法觀察到，在正常腎組織，α－SMA只在腎臟血管中層表達(dá)，而在腎小球和腎間質(zhì)中幾乎無(wú)表達(dá).在腎臟病理?xiàng)l件下，α－SMA可在腎小球系膜區(qū)、腎小球周?chē)g質(zhì)、萎縮的小管周?chē)w維化區(qū)域及血管周?chē)磉_(dá)并增生，參與腎臟纖維化形成［6－7］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠術(shù)后第12天腎間質(zhì)區(qū)域可見(jiàn)大量的α－SMA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，提示腎間質(zhì)纖維化后已有大量的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，且在α－SMA表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)伴有Ⅲ型膠原蛋白的高度表達(dá).

腎小管間質(zhì)纖維化它以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原Ⅲ型)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征.本研究采用VG膠原染色可以清晰的觀察到間質(zhì)內(nèi)膠原隨著病變的加重其沉積逐漸增多.膠原纖維呈束狀或灶狀增生，深粉紅色.經(jīng)芪丑湯治療后間質(zhì)內(nèi)膠原沉積逐漸減少，陽(yáng)性信號(hào)面積比明顯降低，顏色變淺，與依那普利組比較具有明顯的差異性(P ＜0.05).

尿素的長(zhǎng)期毒性作用與其代謝產(chǎn)物氰酸鹽有關(guān)，它可使蛋白質(zhì)發(fā)生氨基甲酰化，如在觸突體膜蛋白發(fā)生這一變化時(shí)，高級(jí)神經(jīng)中樞的整合功能可受到損害.肌酐是肌肉內(nèi)磷酸肌酸的代謝產(chǎn)物，有人報(bào)告肌酐具有溶血、抑制組織對(duì)葡萄糖和氧的攝取、抑制紅細(xì)胞增殖與成熟等作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表1)，芪丑湯可明顯改善RIF大鼠腎功能，加速BuN、Scr等有毒物質(zhì)排出，延緩RIF發(fā)展趨勢(shì).芪丑湯中劑量組同陽(yáng)性藥依那普利組比較，BUN、Scr具有明顯的差異性(P＜0.05);表明芪丑湯對(duì)大鼠單側(cè)輸尿管梗阻后引起的BUN、Scr升高具有明顯的降低作用，并且作用強(qiáng)度強(qiáng)于依那普利陽(yáng)性藥.方中大黃能改善氮質(zhì)代謝，這是因?yàn)榇簏S能減少腸道對(duì)氨基酸(合成尿素的原料)的吸收，增加谷氨酰酶合成酶活性，促進(jìn)氨合成氨酰胺和蛋白質(zhì)，并且抑制肝、腎組織合成尿素，抑制蛋白質(zhì)分解，減少尿素和肌酐的生成，促進(jìn)尿素和肌酐從腎臟排出［8］.藥理研究表明:黃芪、人參、附子、丹參、水蛭均可降 BuN、Scr［9］.

近年研究表明，血膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、氧化型低密度脂蛋白(Ox－LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)及其中間代謝產(chǎn)物與腎間質(zhì)炎癥及纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)，且皮質(zhì)中膽固醇的含量與腎小管間質(zhì)損傷的嚴(yán)重性呈正相關(guān)［10］本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪丑湯對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠所引起的CHO、TG升高具有降低作用，與陽(yáng)性藥依那普利組比較有差異性(P＜0.05).

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎性貧血的發(fā)病機(jī)理主要是由于腎臟產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素(EPO)減少，還與營(yíng)養(yǎng)性貧血、慢性失血性貧血以及體內(nèi)毒素對(duì)骨髓造血的抑制有關(guān).近有學(xué)者報(bào)道紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，也是腎性貧血的機(jī)制之一，改善造血微環(huán)境、恢復(fù)紅細(xì)胞膜的正常和功能利于其病的治療［11］.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:各治療組與模型組比較，可使RBC、Hb明顯升高(P＜0.01);中劑量組與依那普利組比較，RBC、Hb有明顯的差異性(P＜0.05).方中黃芪、人參、茯苓、白術(shù)健運(yùn)脾胃以培后天之本;大黃通腑泄?jié)?半夏化濁降逆;砂仁理氣和胃;丹參行氣活血，共奏補(bǔ)脾益腎，益氣生血之功.現(xiàn)代藥理研究:黃芪能促進(jìn)紅細(xì)胞和血紅蛋白增加［12］.

［1］TANG W W，VAN G Y，QI M.Myofibroblast and alpha 1(III)collagenexpression in experimental tubulointerstitial nephritis［J］.Kidney Int，1997 ，51(4):926.

［2］張 翠.芪丑湯對(duì)腎大部切除大鼠白細(xì)胞黏附分子CD11b，CD44調(diào)控機(jī)制的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(24):1953.

［3］張 翠.溫補(bǔ)脾腎、泄?jié)峄龇▽?duì)慢性腎功能衰竭患者CD44、CD54、TNF－a表達(dá)調(diào)節(jié)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(2):142.

［4］薛 痕，樊均明，陳 亮，等.大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.四川動(dòng)物，2004，23(1):16.

［5］RADFORD G，DONADIO J.Predicting renal outcome in IgA nephroPathy［J］.J Am Soc Nephrol，1997，8(2):199.

［6］MUCHANETA K E C.Myofibroblast phenotypes expression inexperimental renal scarring［J］.Nephrol Dial Trans ，1997 ，12(5):904.

［7］BOUKHALFA G，DESMOULIERE A，RONDEAU E，et al.Relationship betweenalpha－smooth muscle actin expression and fibrotic changes in human kidney［J］.Exp Nephrol.，1996 ，4(4):241.

［8］鄭 豐，黎磊石.大黃對(duì)腎小管細(xì)胞增殖的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1993，73(6):34.

［9］聯(lián)廣信，史玲艾.蟲(chóng)類(lèi)入終藥為主治療慢性腎功能衰竭28例［J］.河北中醫(yī)，1999，21(2):99.

［10］李 婭.血脂與腎間質(zhì)纖維化［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2001，28(10):429.

［11］劉 惠，鄒成鋼，段永壽，等.尿素癥患者紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變及其意義［J］.中華腎臟雜志，1998，14:270－271.

［12］陳雙華，蔣成燕，曹健林.益腎解毒方治療腎性貧血療效分析［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2004，10(5):588.