血液與唾液中葛根素HPLC測定方法的建立

李秋紅，郭 泉，徐軼爾，姜 薇

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

葛根素(puerarin)是中藥葛根的主要有效成分之一，葛根素注射液又是臨床上應(yīng)用較為廣泛的一種劑型，具有擴張冠狀動脈及腦血管、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)的作用，臨床多用于治療心血管疾病［1－2］.隨著葛根素注射液應(yīng)用范圍的擴大和使用人群的增加，不良反應(yīng)報告日趨增多［3－4］，研究其體內(nèi)作用規(guī)律尤為重要，而對體液中葛根素質(zhì)量濃度測定又是最為有效的方法.關(guān)于葛根素血液樣品測定方法和藥動學(xué)研究國內(nèi)已有報道［5－10］，而唾液中葛根素測定方法尚未報道，唾液作為非創(chuàng)傷性采集的體液樣品，其中的藥物質(zhì)量濃度能直接反映血中具有藥理活性的游離型藥物水平，所以本研究旨在建立同時適用于血液和唾液中葛根素的HPLC分析方法，為進一步利用唾液開展臨床藥動學(xué)研究和唾液治療藥物監(jiān)測提供靈敏、簡便、可靠的檢測手段.

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號: 110805－200306);葛根素注射液(寶雞金森制藥有限公司，批號:20061202);大豆苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110805－200306);超純水;其他均為市售色譜純、分析純試劑.

1.2 儀器

LC－2010高效液相色譜儀(日本島津);KL512型氮吹儀(北京成萌偉業(yè)有限公司);XW－80A旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司);TDL－60B低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);SK8200H超聲波清洗器(北京康林科技有限公司);TGL16M高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司).

1.3 實驗動物

本研究選用清潔級Wistar系雄性大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，SYXK(黑)2008－001)，12～14周齡，體重370～420 g，各項生理生化指標穩(wěn)定.

2 方法與結(jié)果

2.1 標準溶液配制

精密稱取葛根素和大豆苷元標準品，分別用甲醇溶解，配制1.0 mg/mL標準儲備液，需要時用甲醇為溶劑逐級稀釋，得到所需質(zhì)量濃度的應(yīng)用液，于－20℃保存待用.

2.2 色譜條件

色譜柱:ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，大連依立特公司);流動相:乙腈–含0.8%冰醋酸的水溶液(22∶78，V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:250 nm.

2.3 樣品處理方法

精密移取100 μL血漿及唾液樣品置于試管中，加入適量的內(nèi)標大豆苷元，并加入甲醇1 mL，漩渦混合1 min后，離心(3 000 r/min)5 min，取上清液0.7 mL，50℃氮氣吹干，200 μL流動相溶解，供HPLC分析.

2.4 標準曲線制備

精密加入葛根素標準溶液于100 μL空白血漿和唾液中，配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、350.0 μg/mL和0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的血漿及唾液標準系列溶液，按“2.3樣品處理方法”操作，在HPLC測定條件下，分別測定葛根素及大豆苷元峰面積，對葛根素與大豆苷元峰面積的比值(y)和葛根素質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，得到葛根素血漿、唾液標準曲線方程分別為y=0.013 6x－0.012 2，r=0.999 4;y=0.429 8x+0.154 1，r=0.999 2，最低定量限分別為5.0、0.1 μg/mL，葛根素的血漿和唾液樣品在5.0～350.0 μg/mL，0.1～5.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.5 專屬性考察

在本方法色譜條件下，按2.3項下處理得到的空白血漿、唾液圖譜在葛根素峰及內(nèi)標峰處無雜峰干擾，如圖1、2所示.

圖1 葛根素血漿樣品色譜圖

圖2 葛根素唾液樣品色譜圖

2.6 精密度與回收率考察

分別精密移取一定體積的葛根素標準溶液于100 μL空白血漿和唾液中，配成高、中、低三個質(zhì)量濃度的血漿、唾液標準樣品(血漿質(zhì)量濃度為350.0、100.0、5.0 μg/mL，唾液質(zhì)量濃度為5.0、1. 0、0.1 μg/mL)，按2.3項下方法處理，進樣分析，同一質(zhì)量濃度樣品一天內(nèi)測定5份，連續(xù)測定5 d，計算血漿與唾液中葛根素的日內(nèi)、日間精密度以及方法回收率，結(jié)果見表1，2.

表1 血漿中葛根素日內(nèi)和日間精密度及方法回收率(n=5，x±S)

表2 唾液中葛根素日內(nèi)和日間精密度及方法回收率(n=5，x±S)

2.7 穩(wěn)定性考察

取高、中、低3個質(zhì)量濃度的標準樣品，進行血漿和唾液樣品復(fù)溶后放置和反復(fù)凍融穩(wěn)定性的考察.

1)樣品經(jīng)處理后，甲醇復(fù)溶放置，每6 h測定一次，結(jié)果表明樣品用甲醇復(fù)溶后室溫避光保存36 h穩(wěn)定，RSD均小于6%，可滿足樣品在長時間(36 h)內(nèi)測定的需要.

2)樣品于在－20℃冷凍保存后反復(fù)融化、冷凍，周期為7 d，每次測定其中有效成分質(zhì)量濃度，測定結(jié)果表明一個月內(nèi)樣品凍融穩(wěn)定性良好(RSD＜5%).

3 討論

本方法在建立過程中，嘗試甲醇－水多種配比系統(tǒng)作為流動相，通過等度洗脫，梯度洗脫對葛根素和大豆苷元的出峰時間、峰面積、峰形等進行考察，均不理想.改為乙腈－水系統(tǒng)作為流動相后發(fā)現(xiàn)，葛根素、大豆苷元與雜質(zhì)峰分離較好.但峰形有拖尾現(xiàn)象，考慮流動相的pH值對色譜峰的峰形有影響，考察了水中加入不同強度酸溶液(醋酸、磷酸、鹽酸)對峰形的影響，發(fā)現(xiàn)水中醋酸比例為0.8%或磷酸比例0.6%時，色譜峰形較好，拖尾現(xiàn)象消失，峰形尖銳且對稱.從保護分離柱角度考慮，本方法選用了酸強度較低的乙腈－0.8%醋酸緩沖液(22∶78，V/V)系統(tǒng)為最終的流動相.

對血漿與唾液樣品預(yù)處理采用蛋白沉淀的提取處理方法，實驗中考察了乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、高氯酸、氯仿六種蛋白沉淀劑的沉淀效果，發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯、乙腈、高氯酸、氯仿為提取溶劑時，色譜圖雜峰多、回收率低、峰形不尖銳，不適于生物樣品中含微量葛根素的提取，而用甲醇、乙醇為提取溶劑時，對比發(fā)現(xiàn)用乙醇提取時峰面積明顯減小，考慮是葛根素在乙醇中溶解度低造成的，最終確定以甲醇為蛋白沉淀提取劑進行血漿及唾液樣品的處理.

建立的反相高效液相色譜法分離測定血漿和唾液中的微量葛根素尚未見文獻報道.該方法針對唾液中葛根素的含量極低的特點，其靈敏度可滿足對葛根素唾液藥動學(xué)進行研究的檢測方法要求，血漿與唾液中最低定量限分別為5.0、0.1 μg/mL，并同時適于血漿和唾液中葛根素的分析，操作簡便，不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，專屬性強，精密度、回收率、穩(wěn)定性均符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求.葛根素在血漿與唾液中不轉(zhuǎn)化為大豆苷元，用大豆苷元作內(nèi)標不干擾葛根素的定量.

該方法不僅是葛根素在唾液樣品中檢測方法的首次建立，還首創(chuàng)了同時適用于血液和唾液樣品中葛根素微量生物樣品中極低含量的測定方法，為葛根素臨床藥動學(xué)研究和唾液治療藥物監(jiān)測提供方法學(xué)基礎(chǔ).

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