大孔樹脂分離純化玉米苞葉總黃酮方法研究

孟 雪，吳 春

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076)

玉米苞葉為禾本科(Gramineae)玉米屬(zea)玉米(zea mays L)的苞葉，一年生草本植物，原產(chǎn)于拉丁美洲，在我國主要分布于北方和西南山區(qū).我國玉米資源豐富，但大量玉米苞葉被廢棄而并沒能得到有效利用.而玉米苞葉中含有豐富的具有抗衰老、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗糖尿病、護(hù)膚美容等作用的黃酮類物質(zhì)［1－2］.大孔吸附樹脂是近十幾年發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，近年來已廣泛應(yīng)用于各種植物和中草藥黃酮類化合物的分離純化過程，樹脂本身的性質(zhì)不同程度地影響著分離純化效果［3－6］.本實(shí)驗(yàn)選用5種大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮粗提物進(jìn)行靜態(tài)吸附解吸，從中選出吸附容量大、易解吸的大孔樹脂，并對(duì)其純化的方法和條件做出了進(jìn)一步的研究，為今后工業(yè)化研究和開發(fā)玉米苞葉黃酮類產(chǎn)品奠定基礎(chǔ).

1 儀器與材料

1.1 材料

玉米苞葉(均采于黑龍江省雙城市同一地點(diǎn)，經(jīng)洗凈、干燥、粉碎機(jī)粉碎、過40目篩等處理呈粉末狀);蘆丁對(duì)照品(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司);纖維素酶(10 000 u/g);S-8、AB-8，X-5，H-103，NKA-9大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠);其他化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純.

1.2 主要儀器設(shè)備

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);植物粉碎機(jī)FZ102型(天津泰斯特儀器有限公司);電子天平FA2004N(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);SHZ-A水浴振蕩器(上海申勝生物技術(shù)有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);721E分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司).

2 試驗(yàn)方法

2.1 玉米苞葉總黃酮的提取及質(zhì)量濃度測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液.分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL刻度試管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入1 mol/LNaOH溶液4 mL，再用無水乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度A(以第一管為測(cè)定空白).得到蘆丁質(zhì)量濃度(X)與吸光度(A)的回歸方程為A=8.7717X－0.0021 (R2=0.9998).

2.1.2 玉米苞葉總黃酮粗提物的制備及質(zhì)量濃度測(cè)定

稱取一定量的玉米苞葉粉末，在酶用量為1.5%，酶解溫度55℃，pH值為5.5的酶解條件下酶解1.5 h，減壓過濾，在濾渣中加入100 mL80%的乙醇，在70℃下水浴震蕩中提取4 h，減壓抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，待測(cè)液的質(zhì)量濃度測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2 玉米苞葉總黃酮粗提物的純化

2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

將市售樹脂用4倍體積的95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后，用乙醇清洗至流出液加適量蒸餾水無白色混濁現(xiàn)象.用蒸餾水洗至無醇，然后用5% HCl溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性;最后用5%NaOH溶液浸泡12 h，再用蒸餾水洗至中性，備用.

2.2.2 大孔樹脂的篩選

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的五種樹脂(AB-8，S-8，X-5，H-103，NKA-9)1.0 g裝入具塞磨口錐形瓶中，加入玉米苞葉類黃酮水溶液(初始質(zhì)量濃度為0.310 mg/mL)17.5 mL，置恒溫水浴振蕩器上在25℃下振蕩24 h.使其達(dá)到飽和吸附，過濾，測(cè)定濾液中剩余黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂25℃下的吸附率(%).然后將經(jīng)靜態(tài)吸附類黃酮后吸附飽和的樹脂濾出，吸干表面水分，加入95%的乙醇50 mL，置恒溫水浴振蕩器上25℃下振蕩24 h，過濾，測(cè)定濾液中類黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂25℃下的解吸率(%).

2.2.3 靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線

稱取2 g樹脂于250 mL的三角瓶中，加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.040 5 mg/mL的玉米苞葉總黃酮粗提液120 mL，室溫置于搖床上連續(xù)震蕩，每小時(shí)定時(shí)取樣，確定合理的吸附時(shí)間.取吸附飽和的樹脂，加入50%的乙醇100 mL，置于振蕩器上，每30 min測(cè)定黃酮質(zhì)量濃度，確定合理的解吸時(shí)間.

2.2.4 動(dòng)態(tài)工藝參數(shù)的考察

將處理好的樹脂濕法裝入內(nèi)徑為2 cm，長為60 cm的樹脂柱后，加入一定量的玉米苞葉總黃酮粗提液，調(diào)節(jié)流速，吸附一定時(shí)間后，先用蒸餾水沖洗去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再加一定質(zhì)量濃度的乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，考察上樣流速、pH值、洗脫速率、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速等玉米苞葉總黃酮的參數(shù)的影響，優(yōu)化工藝.

2.2.5 玉米苞葉總黃酮提取物純度的測(cè)定

取5 g玉米苞葉粉末，用2.1.3的方法提取，濃縮，干燥成干膏，稱重.用醇稀釋溶解，測(cè)定黃酮含量，計(jì)算總黃酮純度.取上述溶液10 mL，揮去乙醇，并用水稀釋至20 mL，根據(jù)最佳工藝參數(shù)上柱、洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥稱重，再用稀醇溶解并定容25 mL，依前法測(cè)定并計(jì)算黃酮純度.

純度=C×V/M×100%

其中:C為純化后黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為黃酮液體積(mL)，M為黃酮物質(zhì)干重(mg).

3 結(jié)果與討論

3.1 大孔樹脂的篩選

從表1可以看出，由于樹脂的極性、孔徑、比表面、孔容等不同，不同類型樹脂對(duì)黃酮的吸附程度不同，綜合吸附率和解吸率兩個(gè)因素，S－8大孔樹脂不僅有較高的吸附率還有較高的解吸率，是比較好的吸附樹脂，更適合玉米苞葉總黃酮的研究，故選擇S－8大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn).

表1 不同大孔樹脂對(duì)玉米苞葉總黃酮的吸附性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

3.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線

3.2.1 靜態(tài)吸附曲線

圖1顯示了S－8樹脂的吸附變化趨勢(shì)，開始的一段時(shí)間內(nèi)，S－8樹脂的吸附率在逐漸增加，隨著時(shí)間的延長，吸附量逐漸達(dá)到飽和.當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到5 h后，樣液質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化趨于平緩，即樹脂吸附已經(jīng)基本達(dá)到平衡.

圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線

3.2.2 靜態(tài)解吸曲線

從圖2可以看出，開始一段時(shí)間內(nèi)，黃酮的解吸逐漸增加;當(dāng)解吸時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，解吸基本達(dá)到平衡.因此，S－8大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮的解吸時(shí)間為1.5 h.

圖2 表態(tài)解吸曲線

3.3 大孔樹脂動(dòng)態(tài)工藝參數(shù)

3.3.1 pH值對(duì)玉米苞葉總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附量的影響

黃酮類化合物為多羥基酚類化合物，具有一定的極性和酸性，所以上柱液pH值對(duì)玉米苞葉黃酮類化合物的吸附效果會(huì)有一定影響.由圖3可知，當(dāng)上樣液pH值偏大時(shí)，玉米苞葉總黃酮有離子化趨勢(shì)而不易被吸附，樣液pH值為4～5時(shí)大孔樹脂吸附量最大，因此，選擇pH值為4～5.

圖3 不同pH值對(duì)大孔樹脂吸附量的影響

3.3.2 上樣流速對(duì)吸附量的影響

圖4表明隨著上柱液流速的增加，吸附量下降，原因是吸附是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，在相同的吸附速度下流速加快必然使相對(duì)吸附的時(shí)間減少，流速過快黃酮類化合物來不及擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面而發(fā)生漏過，導(dǎo)致吸附率降低，故本實(shí)驗(yàn)選擇1 mL/min的速度上樣，從而提高其吸附率.

圖4 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附量的影響

3.3.3 洗脫速率對(duì)解吸率的影響

由圖5所示，解吸率隨著洗脫速率的增加逐步降低，但乙醇洗脫速率在1.5 mL/min和3.0 mL/ min時(shí)解吸率相差不大，考慮生產(chǎn)周期的問題，可以把洗脫速率定為3.0 mL/min.

圖5 洗脫速率對(duì)大孔樹脂解吸率的影響

3.3.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響

由圖6所示，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)解析率達(dá)到最高，然后開始下降，故選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇作為洗脫劑.

圖6 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸率的影響

3.4 玉米苞葉總黃酮純度的測(cè)定

由表2可知，S－8樹脂能提高玉米苞葉總黃酮的純度，純化后的黃酮純度為66.3%，工藝穩(wěn)定可行，純度提高3.5倍.

表2 樹脂純化前后的總黃酮純度

4 結(jié)論

1)通過對(duì)5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附研究，發(fā)現(xiàn)S－8型大孔樹脂是一種比較理想的樹脂，適合玉米苞葉黃酮的純化.

2)S－8大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮的吸附平衡時(shí)間為5 h，解吸平衡時(shí)間為1.5 h，最佳上柱pH值為4～5，以1.0 mL/min的吸附流速上樣，以3倍體積的蒸餾水沖洗再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫用量100 mL，流速3 mL/min.

3)經(jīng)純化后的玉米苞葉總黃酮純度為66.3%.

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