柑橘中冷脅迫相關的m iRNA的RT-PCR鑒定

張金梅，李 煌，汪啟明，饒力群

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物化學與分子生物學研究室，湖南長沙 410128）

MiRNA是一類長約 21～22 nt的內(nèi)源單鏈RNA，不具有開放閱讀框。成熟的miRNA 5′端有磷酸基團，3′端有羥基。miRNA本身不編碼蛋白質(zhì)，但能協(xié)調(diào)許多基因的表達，通過切割靶基因的或抑制其翻譯[1]，調(diào)節(jié)植物的激素分泌和信號轉導，增強植物對惡劣環(huán)境的適應能力[2-5]。此外，植物miRNA還具有保守性、時序性和組織特異性[6-7]，在個體發(fā)育的不同時期或不同組織中有不同的表達模式。

利用微陣列技術從水稻中識別了18個冷脅迫反應miRNAs，大多數(shù)的表達是下調(diào)。其中miRNA167和miRNA319的表達模式相似，miRNA171家族的不同成員表達模式各不相同，呈現(xiàn)出多樣性[8]。采用全基因組分析和高通量測序技術，鑒定了短柄草中多個miRNAs，其中28個miRNAs對冷脅迫反應明顯，所有的27個保守的miRNAs都受冷脅迫表達上調(diào)[9]。但關于柑橘中miRNAs的功能尤其是與冷脅迫的相關性卻是空白，盡管已在柑橘中發(fā)現(xiàn)27個miRNAs[10]。本研究以柑橘為材料，4℃冷脅迫處理不同時間，提取葉片中總RNA,進行逆轉錄合成cDNA，再用半定量RT-PCR擴增，以確定這幾個miRNAs在柑橘中是否存在及經(jīng)冷脅迫處理不同時間后的差異表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試柑橘品種為金橘，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學日光溫室中，常規(guī)栽培管理。將金橘置4℃條件下光照培養(yǎng)箱中冷處理，于 0、0.5、4、8 h 和14 d分別取其幼嫩葉片，-80℃中保存。

1.1.2 儀器與試劑 （1）儀器：高速冷凍離心機、微型離心機、研缽 、烘箱、制冰機、高壓蒸汽滅菌鍋、移液器、電泳儀、凝膠成像分析儀、紫外分光光度計、PCR儀、梯度PCR儀；（2）主要試劑：Trizol（In－vitrogen）、氯仿、異丙醇、DEPC 滅菌水、70%乙醇、逆轉錄酶 M-MLV；RNasin（40 U/μL）、dNTP（2.5 mM/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、pGM-T 克隆試劑盒、重組菌落PCR鑒定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 引物采用PrimerPremier 5.0軟件設計，由上海生工生物技術有限公司合成。所用引物序列如下表1。

表1 所用引物序列

1.2.2 總RNA的提取與質(zhì)量檢測 提取不同時間處理過的金橘葉片中總RNA。先將離心機預冷至4℃，研缽和離心管用液氮預冷，迅速將葉片于研缽中液氮研磨成粉，加到1.5 mL的離心管中，向每個離心管中加入lmL Trizol，振蕩混勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液到另一干凈離心管中，每個離心管中加入200μL氯仿劇烈振蕩，冰上靜置5 min，12 000 r/min離心10min。取上清液到另一干凈離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀10 min，13 000 r/min離心12 min。去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心2 min。去上清，沉淀，室溫中晾干，加入DEPC水中于-80°C保存。

取5μL DEPC滅菌水溶解RNA后點樣，1.5%瓊脂糖凝膠在80V/穩(wěn)壓下電泳30 min，進行RNA完整性檢測。再用紫外分光光度計測得OD260/OD280為1.93，說明此RNA純度很高；濃度為340μg/mL，含量高，適合做RT-PCR。

1.2.3 半定量RT-PCR對不同時間冷脅迫下柑橘中m iRNA的差異表達鑒定 （1）PCR循環(huán)數(shù)的確定：PCR反應中，產(chǎn)物最初為指數(shù)增加，當Taq DNA酶活力不足或反應試劑有限時，擴增產(chǎn)物量會達到飽和。此時，不同濃度的cDNA做模板，產(chǎn)物量會相同。故只有產(chǎn)物量未到平臺期的循環(huán)數(shù)，才能有效檢測擴增前各基因的起始濃度。在22～30個范圍內(nèi)設置了4種不同的循環(huán)數(shù)，以確定目的基因的最佳PCR反應循環(huán)數(shù)，最后確定為miRNA156、miRNA166a、miRNA167d 為 25，miRNA166 為 22，miRNA171為28。

（2）PCR體系的優(yōu)化：為了提高PCR的特異性，又能獲得較多的產(chǎn)物，需優(yōu)化PCR體系的引物量。將預先配好的12.5 mM的引物，分別取不同的量，梯度設置為：0.5、0.8、1、1.2 、1.5 μL，然后根據(jù) PCR產(chǎn)物電泳結果選用合適的引物量，實驗選定為1 μL。為了取得最佳效果，對退火溫度進行優(yōu)化。以引物合成報告單上的退火溫度低5℃為參照，上下2°設置4個溫度梯度，根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結果，確定最佳退火溫度為56℃。

（3）逆轉錄：miRNA 前體帶有 poly（A）尾，可用Oligd（T）進行逆轉錄。對 miRNA167a、miRNA167d和miRNA171采用此法。取純化后的總RNA按下列步驟進行:反轉錄反應體系（20μL）：在RNasefree 0.2 mL離心管中配制下列反應液Total RNA 1～5 μg，Oligo（dT15）Primer（12.5 μM）2 μL，加RNase free H2O到10μL，簡短離心混勻，70℃溫育5 min，冰上急冷3 min。上述反應液10μL中加RNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL，5×PrimerScriptTM Buffer 4 μL，M-MLV（200 U/μL）1 μL，dNTPMixture（2.5 mM）4μL總體積 20μL?；靹?，42℃，60 min，70℃，15min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

miRNA成熟體由于序列長度太短，極易降解，在細胞內(nèi)含量又極其低微，以Oligd（T）為引物很難檢測到。故設計基因特異性的莖環(huán)引物做逆轉錄，再進行PCR擴增。

Stem－loop RT-PCR是一種高效、靈敏特異的小分子miRNA的檢測方法[11-12]，已在多種植物的miRNA檢測中獲得成功[13-14]。對miRNA156和miRNA166采用Stem-loop RT法，純化后的總RNA反轉錄合成cDNA。反應步驟：總RNA 1～5μg，特異莖環(huán)引物（12.5 μM）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）4μL，RNase free H2O 4μL。用槍輕輕吹打混勻，70℃溫育5min，冰上急冷5min。在上述反應管中配制下列反轉錄反應液。加入RNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL，5 ×First strand Buffer 4 μL，M-MLV（200 U/μL）1 μL，dNTPs 4 μL，總反應體系 20 μL?；靹颍?6°C 30min；30℃ 30 s，42℃ 30 s，50℃ 1 s；85℃10min完成逆轉錄反應，-20℃保存。

（4）PCR反應：以上述合成的cDNA為模板，PCR反應擴增目的基因，分別以EF和U6為內(nèi)參基因平衡cDNA模板濃度。20μL的PCR反應體系中含 cDNA 2μL，上下游引物（12.5μM）各 1μL，dNTP Mixture（2.5 mM）4 μL，PCR Buffer 2 μL，DNA polymerase 0.35 μL，補 ddH2O 至 20 μL，混勻，按照以下程序進行擴增:94℃變性5min；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1min，25 個循環(huán)；然后72℃保持5min。將上述RT-PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中點樣，在電壓80 V的TAE緩沖液中電泳20min，取出凝膠，紫外成像后，比較條帶強弱，確定miRNA基因在不同時間冷處理時的表達情況。

1.2.4 序列測定 擴增的目的基因產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按說明書進行回收。用10 μL無菌ddH2O溶解已純化的回收片段，通過紫外分光光度計測定濃度，確定DNA與PGM-T載體的連接比例。將TOP10感受態(tài)細胞放置冰上，完全溶解后，輕輕將細胞混勻。吸取5μL的重組反應產(chǎn)物加入到50μL感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰上放置30min。42℃熱激90 s，冰上放置3min。加入450 mL 37℃的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h。將大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素和IPTG和XGal的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選圓且亮的白色菌落，加LB液體培養(yǎng)基做菌落擴大培養(yǎng)后，保存在1.5 mL EP管中，EP管中預先加入1 mL的LB液體培養(yǎng)基和15%的甘油和適量的氨芐青霉素混勻，送上海生工測序。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

如圖1所示，出現(xiàn)三條主帶（28SrRNA、18Sr－RNA、5SrRNA），且 28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明所提取的RNA較完整。

2.2 半定量RT-PCR對miRNAs的差異表達鑒定結果

如圖2、圖3所示，3種miRNAs前體（miRNAs167a、miRNAs167d、miRNAs171） 和 2 種 miRNAs的成熟體均被檢測到，說明了半定量RT-PCR對柑橘中miRNAs鑒定的可行性及stem loop RTPCT對小分子miRNAs的檢測具有高效性和靈敏性。實驗鑒定了5種柑橘miRNA在不同時間冷脅迫處理后的差異表達情況，隨著冷處理時間的延長，miRNA156和 miRNA171的表達量逐漸增加，而miRNA166的表達量在8 h內(nèi)幾乎沒什么變化，經(jīng)過14 d的冷馴化后，略有減弱。miRNA167a和miRNA167d的變化趨勢一致，先是表達量下降，8 h時出現(xiàn)回升，長期冷馴化后，呈下調(diào)趨勢。除miRNA166外，其余4個被檢測的miRNAs均在4℃冷脅迫0.5 h后反應明顯。

2.3 測序結果

miRNA156、miRNA167a、miRNA167d 及 miRNA171的測序結果與預測相符，miRNA166雙向測序后發(fā)現(xiàn)有重疊現(xiàn)象，懷疑是質(zhì)粒模板本身與使用的引物之間存在多個結合位點，導致測序過程中擴增出多套模板?？赡苁怯捎趍iRNA166逆轉錄時使用的是具有發(fā)夾結構的莖環(huán)引物，發(fā)夾結構的互補序列均可與引物結合所致。

3 結論與討論

實驗鑒定了5個柑橘miRNA，并發(fā)現(xiàn)它們在4℃冷處理不同時間時各個miRNA的差異表達情況及其表達模式。關于冷脅迫的研究多在模式植物擬南芥中進行，這種抗寒性miRNA在植物中保守存在[15]。本研究也表明miRNA在擬南芥和柑橘中具有保守性。不僅在序列結構上是保守的，而且在功能上也是高度保守的。不同的miRNA在植物體內(nèi)的表達差異顯著，在冷脅迫下參與基因表達調(diào)控，以應對逆境刺激。不同的miRNA對基因表達的調(diào)控模式不同，并隨時間變化。

以前對植物冷脅迫后miRNAs的表達研究時間很少有超過24 h，本研究設計了2周的冷馴化處理并觀察了處理后的miRNAs的表達量的變化。但對這些miRNAs是如何感受溫度變化，又是如何通過其靶基因來將信號整合進低溫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡并提高柑橘的冷適應能力還不清楚。本研究以冷脅迫為切入點，其研究策略對于其他的脅迫反應如干旱、鹽堿等脅迫環(huán)境中miRNA的研究具有一定的指導意義。

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