豬傳染性胃腸炎病毒S基因的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測

張云，王亞賓，陳麗穎，張紅英，侯貝貝，崔保安，胡慧

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染病。不同年齡和品種的豬均可感染，3周齡以下仔豬的致死率可達(dá)100%。該病呈全球性分布，已成為重要的豬病毒性腹瀉病之一[1]?；旌闲愿腥竞图?xì)菌繼發(fā)感染常使臨床癥狀復(fù)雜化，根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀，只能對該病作出初步診斷，特別是不能有效地區(qū)分TGEV與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）及豬輪狀病毒（PRV）感染[2-4]，因此，豬傳染性胃腸炎病毒快速檢測方法的研究對豬傳染性胃腸炎的預(yù)防和控制具有重要意義。目前，檢測TGEV的常規(guī)方法主要有病毒分離鑒定、電鏡觀察、ELISA、免疫熒光抗體試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、常規(guī)RT-PCR和多重RT-PCR技術(shù)等，但這些方法操作繁瑣，不能進(jìn)行定量分析且靈敏度不高[5-9]。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（real-time PCR）可以對初始模板定量，具有操作簡便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，且整個過程無需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳等后期處理，可以有效防止檢測過程中的污染及假陽性，可大大提高檢測效率。該方法在病原體定性和定量檢測方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[10]。筆者以豬傳染性胃腸炎病毒纖突糖蛋白S基因?yàn)榘谢?，旨在建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法，對TGE的快速診斷與監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和菌株

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）疫苗株、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型病毒（PCV-2）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬乙型腦炎病毒（JEV）以及大腸桿菌DH5α均由河南省動物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器

pGEM-T Easy載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4DNA連接酶均購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；SYBR? Premix ExTaq?Ⅱ聚合酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。PCR儀（PTC 200）為美國MJResearch公司產(chǎn)品；Rotor-Gene 3000型實(shí)時定量PCR擴(kuò)增儀為澳大利亞Corbett Reseach公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑及儀器均由河南省動物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 引物的設(shè)計與合成

應(yīng)用Primer Premier 5.0生物軟件，參照GenBank發(fā)表的TGEVS基因序列（NC002306）設(shè)計1對引物，上游引物序列為5′-GTATTGGGATTATGCT-3′；下游引物序列為5′-CCACAATTTGCCTCTG-3′，預(yù)計擴(kuò)增片段為258 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 TGEV S基因的RT-PCR

按Invitrogen公司的TRIzol試劑說明書提取病毒總RNA，提取的RNA用20 μL無RNase水溶解沉淀，－20 ℃保存。以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行cDNA合成，隨后進(jìn)行PCR或置于－20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中PremixTaq12 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL （50 pmol/μL），加去離子水至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 重組質(zhì)粒模板的制備

將PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pGEM-T Easy載體，并將其轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取疑似陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切鑒定，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒菌液送寶生物工程（大連）有限公司測序驗(yàn)證。

1.6 SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光定量RT-PCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取經(jīng)序列測定驗(yàn)證的陽性重組質(zhì)粒，用紫外分光光度計測定質(zhì)粒模板的濃度，計算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。按10倍梯度稀釋，將其作為實(shí)時熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。通過預(yù)試驗(yàn)對TGEVS基因的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為20 μL，其中，上、下游引物各0.5 μL，SYBR? Premix ExTaq? Ⅱ聚合酶10 μL，模板1 μL，滅菌去離子水8 μL。將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：95 5 min℃ ，95 10 s℃ ，56 15 s℃ ，72 15 s℃ ；45個循環(huán)。利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，得到動力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性、重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)設(shè)計

分別提取CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV和JEV陽性樣品的RNA/DNA，其中，CSFV、PRRSV和JEV為提取病毒RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA，以PBS為陰性對照，按本試驗(yàn)所優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光定量PCR，通過對Ct值和溶解曲線峰值溫度進(jìn)行分析，驗(yàn)證其特異性。

將已制備的TGEVS基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以此計算出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)。

選取TGEV同一濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)，每一個樣品同時做2個重復(fù)，驗(yàn)證TGEV SYBR Green I熒光定量PCR方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品檢測結(jié)果比較

取60份臨床病料進(jìn)行處理，提取RNA，用所建立的熒光定量RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同時進(jìn)行檢測，比較2種方法的檢出情況，同時設(shè)置陽性病料和陰性病料作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGEV S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果與測序分析

以TGEVS基因設(shè)計引物并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，得到約250 bp的目的片段，與預(yù)期的條帶一致（圖1）。將陽性目的片段切膠回收、純化、克隆到pGEM-T Easy載體，得到陽性重組質(zhì)粒。將其測序結(jié)果與GenBank進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果證實(shí)該擴(kuò)增產(chǎn)物與TGEVS基因相應(yīng)區(qū)域的同源性為100%。

圖1 TGEV S基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR result of S gene of TGEV

2.2 TGEV S基因的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)樣品按10倍倍比稀釋，通過預(yù)試驗(yàn)，篩選出3×106、3×105、3×104、3×103、3×102拷貝/μL共 5個稀釋度的重組質(zhì)粒，分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為3×106～3×102拷貝/μL時可以得到較為理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.984 5。

圖2 TGEV S基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of real-time PCR for TGEV S gene

7個濃度標(biāo)準(zhǔn)品的溶解溫度為87.7～88.5 ℃，約有1 ℃的波動，屬于正常范圍，平均溶解溫度約為88.1 ℃，波峰高度與質(zhì)粒濃度呈正相關(guān)（圖3）。

圖3 TGEV S基因熒光定量PCR的溶解曲線Fig.3 The melting curves of real-time PCR for TGEV S gene

2.3 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

按照上述SYBR Green I熒光定量反應(yīng)體系對TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV和JEV的陽性樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，只有TGEV出現(xiàn)了單一的S型擴(kuò)增曲線，而CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV和JEV均不能檢測出S型曲線（圖4），表明所建立的針對TGEV的熒光定量PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖4 TGEV S基因熒光定量PCR的特異性檢測Fig. 4 Specificity of real-time PCR for TGEV S gene

2.4 熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將制備的質(zhì)粒模板按10倍倍比分別稀釋成3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×10、3拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，并分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線（圖5）。結(jié)果顯示其靈敏度為30拷貝/μL。

圖5 TGEV S基因熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity of real-time PCR for TGEV S gene

2.5 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖6 TGEV S基因熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Repeatability of real-time PCR for TGEV S gene

由圖6可知，同一濃度所得的S型曲線相似，實(shí)際所得的Ct值基本相同，變異很小，可見所建立的TGEVS基因的熒光定量PCR方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品檢測

通過對60份疑似TGEV糞樣用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR進(jìn)行檢測，共檢測到28份陽性、32份陰性，而普通RT-PCR檢測到20份陽性、40份陰性，說明SYBR GreenⅠ熒光定量方法檢測TGEV的靈敏度比普通RT-PCR方法高，能檢出普通RT-PCR不能檢出的病料。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，根據(jù)GenBank收錄的TGEV-Miller毒株的S蛋白基因序列，設(shè)計合成1對特異性引物，用RT-PCR方法從疫苗株中擴(kuò)增TGEVS基因的部分保守片段，并克隆到pGEM-T Easy載體上，得到重組質(zhì)粒作為熒光定量RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了TGEV的熒光定量RT-PCR檢測方法。結(jié)果表明：該方法檢測靈敏度可達(dá)30 拷貝/μL，與豬圓環(huán)病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒和豬流感病毒和豬細(xì)小病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床TGEV感染的早期診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查。

TGEV纖突糖蛋白（S蛋白）是由約4. 35 kb的S基因編碼的糖蛋白，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白，是免疫預(yù)防和診斷研究的重點(diǎn)。在S基因的近N端包含了4個主要的抗原決定位點(diǎn)A、B、C、D，而呼吸道冠狀病毒（PRCV）是TGEV的基因缺失變異株，二者核苷酸序列的同源性達(dá)96%，與TGEV相比，PRCV在S基因N末端有621～681個堿基不等的缺失[8]。本試驗(yàn)中根據(jù)TGEV的S基因序列，選取了擴(kuò)增PRCV缺失的部分S基因，建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法在臨床上可以用來區(qū)分TGEV和PRCV。

TGEV檢測的發(fā)展趨勢是檢測方法必須簡便、快速、特異、靈敏和批量檢測。熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于TGEV檢測，能在病毒隱性感染和豬發(fā)病早期進(jìn)行快速確診和實(shí)時監(jiān)測，但目前的研究尚少。Chen等[10]以Invitrogen公司的LUX （light upon extensi on, LUX）引物為基礎(chǔ)建立了檢測 TGEV的熒光定量PCR方法，其檢測敏感性比常規(guī)RT-PCR方法提高了10倍。白興華[11]等根據(jù)TGEV的N基因和豬肌動蛋白的基因序列設(shè)計合成引物和探針，進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，其檢測敏感性達(dá)15.3拷貝/μL。徐麗秋等[12]根據(jù)TGEVN基因的保守區(qū)序列設(shè)計合成引物和探針，建立了一種特異、靈敏、快速的TaqMan熒光定量RT- PCR方法，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比，其靈敏度高100倍。與TaqMan 探針法相比，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法更加簡便，只需在SYBR GreenⅠ反應(yīng)混合液中加入引物和待測樣品，其成本相對低廉，且無需合成價格昂貴的探針。選用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR來檢測TGEV具有良好的重復(fù)性和特異性，其最低檢測限為30 拷貝/μL。與普通RT-PCR相比，SYBR GreenPCRⅠ 的擴(kuò)增和檢測都在同一管內(nèi)完成，不需要后續(xù)的電泳檢測，有效解決了污染問題，而且操作更簡便，檢測時間不到3 h，是一種快速、有效檢測TGEV的方法，可用于臨床TGEV感染檢測。

[1] 殷震，劉景華．動物病毒學(xué)[M]．2版．北京：科學(xué)出版社，1997：1137-1182．

[2] Jung K，Kim J，Kim O，et al．Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by multiplex RT-nested PCR and comparison with in situ hybridization[J]．J Virol Methods，2003，108（1）：41-47．

[3] Song D S，Kang B K，Oh J S，et al．Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus，transmissible gastroenteritis virus，and porcine group a rotavirus[J]．J Vet Diagn Invest，2006，18（3）：278-281．

[4] Ben S A，Chupin S A，Bjadovskaya O P，et al．Multiplex nested RT-PCR for the detection of porcine enteric viruses[J]．J Virol Methods，2010，165（2）：283-293．

[5] 徐麗秋，賈斐，劉海防，等．豬傳染性胃腸炎分子生物學(xué)診斷方法[J]．中國動物檢疫，2008，25（8） ：52-54．

[6] 李小蘭，聶福平，李應(yīng)國，等．豬傳染性胃腸炎病毒NASBA檢測方法的建立[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32（6） ：451-454．

[7] Liu C，Kokuho T．A serodiagnostic ELISA using recombinant antigen of swine transmissible gastroenteritis virus nueleoprotein[J]．J Vet Med Sci，2001，63（11） ：1253-1256．

[8] Carman S，Josephson G．Field validation of a commercial blocking ELISA to diferentiate antibody to transmissible gastroenteritis virus （TGEV） and porcine respiratory colonavirus and to identify TGEV infected swine herds[J]．Vet Diagn Invest，2002，14（2）：97?-105．

[9] 賈贊，胡傳偉，簡中友，等．檢測豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR方法的建立[J]．檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2006，16（4）：12-15．

[10] Chen R，Huang W M，Lin Z X，et a1．Development of a novel real-time RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus[J]．J Vir Met，2004，122：57-61．

[11] 白興華，原志偉，李軍民，等．TaqMan熒光定量RT-PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒的研究[J]．檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2009，19 （5）：17-20．

[12] 徐麗秋，蘇永生，趙玉軍，等．檢測豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立與初步應(yīng)用[J]．畜牧與獸醫(yī)，2009，41（9）：14-17．