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    鴨肝炎病毒現(xiàn)場分離株單克隆抗體的研制

    2011-03-07 15:00:20周珍輝陳萬榮周育森向雙云曹金元李玉冰楊久仙曹授俊田璐張浩
    關(guān)鍵詞:雜交瘤尿囊腹水

    周珍輝,陳萬榮,周育森,向雙云,曹金元,李玉冰,楊久仙,曹授俊 ,田璐,張浩

    (1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系,北京 102442;2.中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所,北京 100071)

    Ⅰ型鴨病毒性肝炎(serotypeⅠ duck viral hepatitis,DHV Ⅰ )由Ⅰ型鴨肝炎病毒引起,以發(fā)病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征,臨床表現(xiàn)為痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀,主要病變?yōu)楦闻K出血、壞死和腫脹,是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一[1-4]。筆者對分離的DHV進行純化,并制備單克隆抗體,旨在建立特異性強、敏感性高、簡便快速的DHV檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    毒株由北京某鴨場分離,經(jīng)動物試驗、鴨胚尿囊腔接種、PCR診斷,確診為Ⅰ型鴨肝炎病毒[5-6]。試驗動物BALB/c小鼠由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心提供;SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子病原研究室提供;抗體亞類試劑盒購自Gibco公司;10日齡鴨胚及1日齡雛鴨購自北京三江宏利牧業(yè)有限公司。

    1.2 抗原制備及鑒定

    1.2.1 DHV抗原的純化

    將臨床發(fā)病鴨的肝臟制成懸液,通過尿囊腔接種10日齡鴨胚,收集接種后4~5 d死亡的鴨胚尿囊液,反復(fù)凍融后,4 ℃ 6 000 r/min離心,去沉淀,取上清,加等量氯仿,振搖20 min,4 ℃ 6 000 r/min離心,去沉淀,取上清,重復(fù)上述過程6次,收集上清液。在收集的上清液中加入10% PEG6000及終濃度為0.4 mol/mL的NaCl,4 ℃磁力攪拌過夜后,4℃1 2 000 r/min離心,去上清,沉淀加少量pH7.4、0.01 mol/mL PBS重懸,再經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心純化[7]。設(shè)30%和60% 2個蔗糖梯度,于10 mL離心管中,每一梯度溶液加4 mL,最后在溶液面上加粗提抗原2 mL,經(jīng)35 000 r/min離心4 h,分別收集各明顯的梯度帶。純化抗原作適當(dāng)稀釋,磷鎢酸負(fù)染,透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)及純度。純化病毒作免疫原免疫動物用和包被抗原檢測抗體用。純化抗原的蛋白質(zhì)量濃度為0.77 mg/mL,-80 ℃冰柜凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 正常尿囊液抗原的制備

    在制備DHV尿囊液的同時,取正常14至15日齡鴨胚尿囊液,同步純化蛋白。除不進行超速離心外,其余按1.2.1的方法進行,檢測蛋白質(zhì)量濃度為1.94 mg/mL,作包被抗原間接ELISA法篩選抗體時排除非特異用,-80 ℃冰柜凍存,作為陰性抗原對照。

    1.2.3 純化抗原的病原性鑒定

    將提純抗原經(jīng)0.22 μm濾膜處理,接種10日齡鴨胚5枚,對照組鴨胚注射生理鹽水,每天照蛋2次,逐日統(tǒng)計鴨胚死亡情況;采取頸背部皮下注射的方式,注射1日齡雛鴨5只,對照組雛鴨注射生理鹽水,觀察雛鴨發(fā)病死亡情況。

    1.3 免疫BALB/c小鼠

    第1次免疫時取純化抗原與福氏完全佐劑等量混合,充分乳化后,按每只100 μg(每只0.5 mL)的抗原量,采取腹部皮下兩點注射的方式,注射8 周齡BALB/c 雌性小鼠3 只,另取1只小鼠注射生理鹽水為對照;2周后取純化抗原與福氏不完全佐劑乳化后進行第2次免疫,方法與第1次免疫相同;4周后進行第3次免疫,方法與第1次免疫相同;6周后從免疫小鼠和對照小鼠的尾尖采血,分離血清,將純化的DHV抗原分別以2、5、10 μg/mL包被96孔板,同時用純化的正常尿囊液蛋白按上述濃度分別包板,用間接ELISA法檢測血清中的抗體含量。當(dāng)免疫小鼠抗體含量較高時,融合前加強一次免疫,直接用純化抗原經(jīng)腹部皮下分兩點注射免疫小鼠,第4天后取抗體含量最高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選抗體。

    1.4 雜交瘤細(xì)胞株的融合和篩選

    參照文獻(xiàn)[8-9],取抗體含量最高免疫小鼠的脾細(xì)胞和處于對數(shù)生長期的SP2/0 細(xì)胞,按(1∶5)~(1∶10)的比例進行融合,融合后分裝5塊96孔板,置37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中,用篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng),1周后改用HT培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞生長狀況,7~9 d用間接ELISA法 進行檢測篩選。用純化抗原與純化正常尿囊液蛋白分別包被96孔板,蛋白濃度為10 μg/mL,每孔100 μL,4 ℃過夜,次日用PBS-Tween-20洗滌3次,每孔加入100 μL初篩抗體,37 ℃作用1 h,用同樣的方法洗板3次,加入酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37 ℃作用30 min,洗滌3次,加入顯色劑顯色后,再加終止液終止,用酶標(biāo)儀測定OD值。選擇經(jīng)純化抗原檢測后OD值較高且與正常純化尿囊液蛋白無反應(yīng)的陽性孔進行亞克隆。用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)進行3次亞克隆后,上清檢測陽性率達(dá)100%的單克隆孔進行擴大培養(yǎng),凍存細(xì)胞株,制備腹水。

    1.5 腹水的制備、效價檢測及特異性鑒定

    1) 腹水的制備。參照文獻(xiàn)[8],給每只BALB/c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟油0.5 mL,2 周后再注射雜交瘤細(xì)胞,每株單抗注射4只小鼠,每只0.5 mL,每1 mL含1×106個雜交瘤細(xì)胞。2 周左右有腹水產(chǎn)生,抽取腹水,56 ℃滅活凍存,備用。

    2) 腹水效價的測定。將純化抗原與純化正常尿囊液蛋白包板后,用間接ELISA法檢測腹水中的抗體效價。包被用抗原量為10 μg/mL,每孔100 μL。

    3) 腹水的特異性鑒定。將腹水1∶100稀釋,分別用純化DHV抗原、正常純化尿囊液蛋白和乙型肝炎表面抗原(HBS)包板,用間接ELISA法檢測。

    1.6 單克隆抗體亞類鑒定

    用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測定8株單抗的類型。按說明書,用ELISA法進行檢測。

    1.7 鴨胚中和試驗

    采用固定病毒-稀釋抗體法[10]進行EID50的測定:取經(jīng)尿囊腔繁殖的病毒液用PBS進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋,每個稀釋度尿囊腔接種5枚10日齡鴨胚,7 d內(nèi)逐日觀察鴨胚的死亡情況,計算出200個TCID50的含量。將7株單抗所產(chǎn)生的腹水用濾膜過濾后,用PBS作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀釋,用含200個TCID50的DHV病毒液分別與7株單抗原液不同稀釋度的腹水等量混合,37 ℃作用2 h后,各稀釋度尿囊腔接種10日齡鴨胚5枚,0.2 mL/枚,另設(shè)5枚接種病毒,作為對照。逐日觀察9 d,記錄鴨胚死亡情況。

    1.8 雛鴨保護試驗

    1日齡雛鴨分為8組,每組8只,前7組分別頸背部皮下接種DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12腹水0.5 mL,24 h后接種含毒尿囊液0.2 mL,第8組只接種含毒尿囊液0.2 mL,作為對照。各組鴨分開飼養(yǎng),連續(xù)觀察7 d,記錄各組鴨的死亡情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗原的純化及鑒定結(jié)果

    病毒經(jīng)凍融氯仿反復(fù)處理及離心后,去除了大量的雜蛋白,經(jīng)PEG-6000 濃縮后,病毒蛋白含量大大提高。濃縮抗原經(jīng)蔗糖密度梯度離心,共出現(xiàn)了2個明顯條帶。約位于30%蔗糖梯度間的條帶為病毒帶。在電鏡下可見直徑20~40 nm的病毒粒子,呈球形或類球形,顆粒結(jié)構(gòu)清晰,大小、結(jié)構(gòu)均符合Ⅰ型DHV特征(圖1)。將純化抗原接種鴨胚后可導(dǎo)致鴨胚全部死亡,胚體出血明顯。攻毒1日齡雛鴨2~3 d后死亡,肝臟上有針尖到米粒大小的出血斑點。

    圖1 鴨肝炎電鏡照片F(xiàn)ig.1 Electricity lens picture of DHV

    DHV病毒的純化方法較多,在前期工作中用硫酸銨沉淀病毒后,發(fā)現(xiàn)雜蛋白多,病毒的形態(tài)被破壞,結(jié)構(gòu)模糊[11-12]。通過反復(fù)凍融,氯仿去脂,PEG沉淀,蔗糖密度梯度離心后,得到了較純的DHV,電鏡下可見大量DHV顆粒,通過鴨胚尿囊腔接種,感染鴨胚全部死亡,說明經(jīng)過上述純化后,抗原保持了良好的活性。

    2.2 小鼠免疫結(jié)果

    小鼠三免后采血,純化抗原包板后,檢測出3只免疫小鼠血清抗體的效價為(1∶400)~(1∶16 000),正常小鼠的效價<(1∶100)。正常純化尿囊液蛋白包板后,用間接ELISA法檢測出3只免疫小鼠及正常小鼠血清抗體的效價均<1∶100。由此,可以排除分泌針對正常尿囊液抗體的雜交瘤細(xì)胞株。10 μg/mL抗原用量包板后所測得的OD值優(yōu)于2、5 μg/mL的抗原用量,故在進行單克隆抗體的篩選中,將包板的最佳抗原用量定為l0 μg/mL。

    免疫小鼠血清抗體含量檢測結(jié)果顯示,用純化抗原包板檢測的OD值顯著高于用正常純化尿囊液蛋白包板所測得的OD值。由此可知,免疫小鼠血清中的抗體主要由注射DHV抗原所致,小鼠免疫效果好,免疫用的DHV抗原純度較高。

    2.3 雜交瘤細(xì)胞株的融合和篩選結(jié)果

    細(xì)胞融合經(jīng)過初次檢測,3次亞克隆后,共篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞8株,分別命名為DHV-1、 DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12。在亞克隆過程中,有DHV-2、DHV-3、DHV-4、DHV-5共4株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體特性丟失。DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12經(jīng)過多次傳代、凍存復(fù)蘇后,保持了穩(wěn)定分泌抗體的功能。在初次篩選時,選用OD值0.5以上的陽性孔進行亞克隆,這樣可以更多地篩選出陽性的雜交瘤細(xì)胞株而不致于丟失。正常純化的尿囊液以10 μg/mL包板篩選單克隆抗體時,OD值均為0.01~0.10,因此,篩選陽性孔時基本排除了非特異性反應(yīng)。

    2.4 腹水的效價及特異性鑒定結(jié)果

    正常純化尿囊液蛋白包板后,用間接ELISA法檢測8株單抗腹水中的抗體效價均<(1∶100)。將純化抗原包板后,用間接ELISA法檢測8株單抗腹水中的抗體效價,DHV-7、DHV-8為1∶1 000,DHV-6、DHV-10為1∶8 000,DHV-1、DHV-9、DHV-11和DHV-12為(1∶32 000)~(1∶512 000)。由此可知,腹水中的抗體主要是針對DHV抗原產(chǎn)生的。經(jīng)間接ELISA法鑒定,所制備的單克隆抗體與乙型肝炎表面抗原、正常純化尿囊液蛋白無交叉反應(yīng),表明所制備的雜交瘤細(xì)胞具有良好的特異性。

    2.5 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

    經(jīng)MAb亞類鑒定,所獲得的雜交瘤細(xì)胞株DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-10為IgG1亞類,DHV-1、DHV-12為IgG2a亞類,DHV-2、DHV-9、DHV-11為IgG2b亞類,輕鏈均為k鏈。

    2.6 鴨胚中和試驗結(jié)果

    接種病毒的鴨胚在接種后3~4 d全部死亡。DHV-6、DHV-7、DHV-9、DHV-10能原倍中和病毒,2倍稀釋后中和保護率為50%,各稀釋度均能明顯延緩鴨胚的死亡。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12原倍中和的保護率為50%,各稀釋度均能明顯延緩鴨胚的死亡。

    2.7 雛鴨保護試驗結(jié)果

    保護試驗結(jié)果顯示,DHV-6、DHV-7、 DHV-9、DHV-10單抗對雛鴨的保護率為50.0%~62.6%。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12 4株單抗對雛鴨的保護率差,在25%以下。

    3 結(jié)論與討論

    正常鴨胚尿囊液中的混雜物很多,需對尿囊液中的病毒進行純化。本研究中,在抗原純化、小鼠免疫、雜交瘤細(xì)胞株的融合篩選、腹水效價檢測試驗中,均以正常尿囊液作對照,免疫用的DHV抗原純度較高,排除了非特異性反應(yīng)。在試驗過程中,為防止細(xì)胞的突變返祖,確保骨髓瘤細(xì)胞對HAT的敏感性,每3~6個月應(yīng)用8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)篩選1次。細(xì)胞融合后第1次克隆化的時間應(yīng)盡可能早,越早越不容易丟失陽性克隆。要盡早檢測,以確定細(xì)胞融合后的克隆是否分泌特異性抗體。一旦檢測為陽性,則不論其細(xì)胞克隆的大小,應(yīng)立即進行克隆化,這是保證克隆化成功、獲得穩(wěn)定分泌McAb雜交瘤細(xì)胞系的非常重要的一環(huán)。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期再克隆,以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失,從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

    [1] 孫剛, 張加勇, 王宇祥, 等. 黑龍江省鴨肝炎病毒HD-I的分離與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科技, 2007, 34(7): 63-65.

    [2] 張展. Ⅰ型鴨病毒性肝炎的診斷與防治[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊, 2008, 126(2): 19-20.

    [3] 蘇環(huán). 雛鴨病毒性肝炎的診治[J]. 浙江畜牧獸醫(yī), 2009 (4): 14.

    [4] 謝運鋒. 中藥在防治雛鴨病毒性肝炎中的應(yīng)用[J]. 廣西畜牧獸醫(yī), 2009, 25 (5): 276-277.

    [5] 周珍輝, 李玉冰, 楊新建,等. 雛鴨病毒性肝炎的分離與初步鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2008, 35(3): 75-76.

    [6] 周珍輝, 陳萬榮. 用RT-PCR診斷Ⅰ型鴨肝炎病毒[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2008, 34(3): 338-340.

    [7] 孫泉云, 劉虹, 李勁松, 等. 間接ELISA檢測鴨肝炎病毒抗體的研究[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 1997, 17(5): 347-349.

    [8] 徐志凱. 實用單克隆抗體技術(shù)[M]. 西安: 陜西科學(xué)技術(shù)出版社, 1992: 55-68.

    [9] 金伯泉. 細(xì)胞和分子生物免疫學(xué)實驗技術(shù)[M]. 西安:第 四軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2003: 21-45.

    [10] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(xué)[M]. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 11.

    [11] 楊萍萍, 宋敏訓(xùn), 艾武, 等. 鴨肝炎病毒單克隆抗體的研制[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2006, 28(8): 212-216.

    [12] 羅函祿, 徐漢祥, 范文明, 等. 鴨病毒性肝炎病毒的純化及電鏡觀察[J]. 中國畜禽傳染病, 1990, 52(3): 1-2.

    英文編輯:羅文翠

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