利用熒光分析法測(cè)定玉米須中的總黃酮含量

曹葉霞，張海容，尹愛萍，何盛寶

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西 忻州 034000）

玉米須為禾本科玉蜀屬植物玉米（Zea mays L.）的花柱和柱頭，它含有多種化學(xué)成分，如揮發(fā)油、皂苷、生物堿、黃酮類、多聚戊糖、尿囊素、有機(jī)酸等。其味淡、性平，有利尿、泄熱、平肝、利膽之功效，可用于治療腎炎、膽結(jié)石、糖尿病、黃疸、麻疹、乳糜血尿、血崩等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，玉米須有顯著的利尿[2]、降血糖[3]、抑菌[4-5]、降壓、增強(qiáng)免疫[6]、抗癌[7]等功效。

玉米須是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，全國(guó)各地均廣泛栽培玉米，因此，作為玉米副產(chǎn)物的玉米須資源十分豐富，但對(duì)它的開發(fā)利用非常有限，除少量入藥外，大部分被白白丟棄。鑒于玉米須既有明顯的藥理價(jià)值，又具備一定的食療特征，進(jìn)行工業(yè)化開發(fā)利用前景相當(dāng)廣闊。作為玉米須主要活性成分之一的黃酮類單體，國(guó)內(nèi)至今尚未見報(bào)道，國(guó)外研究也不多。目前，測(cè)定食品及中草藥中黃酮類的方法有直接測(cè)定法、紫外測(cè)定法[8-11]、三氯化鋁比色法、硝酸鋁比色法[12]、HPLC法等。

為了尋求操作簡(jiǎn)便、成本低、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，本研究根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，提出采用熒光光度法測(cè)定總黃酮的含量[13]。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

玉米須采于忻州市。將玉米須用蒸餾水洗凈，陰干，然后粉碎過(guò)篩，裝入試劑瓶待用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為北京化學(xué)試劑公司提供。

主要儀器:F-4500型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）、KQ-100DB型數(shù)控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）、AL204精密電子分析天平（上海梅特斯-托利多儀器有限公司）和SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取玉米須粉20.0000g置于100mL錐形瓶中，按料液比為1∶20加入60%乙醇溶液，在功率400 W下，超聲處理20 min，過(guò)濾，用60%乙醇定容至100 mL；然后從中吸取5 mL至25 mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容；再?gòu)闹形? mL，置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液6 mL，用60%乙醇定容，搖勻。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取蘆丁20.0 mg，用60%的乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，即配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分別置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇溶液定容、搖勻，即配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 測(cè)定 在激發(fā)光譜通帶5.0 nm，發(fā)射光譜通帶5.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)λex=445 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=542 nm的條件下，測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度與相應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在相同條件下測(cè)定樣品中總黃酮的熒光強(qiáng)度，再用回歸方程求解其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光化合物的激發(fā)及發(fā)射光譜

按實(shí)驗(yàn)方法選擇光譜通帶寬度，對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的激發(fā)及發(fā)射光譜進(jìn)行掃描。所得激發(fā)及發(fā)射光譜如圖1所示，所得激發(fā)及發(fā)射光譜分別為445，542 nm。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 pH值 溶液的pH值影響絡(luò)合物的形成和熒光強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液呈酸性，pH=4.74～6.74時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度最大（圖2）。所以，實(shí)驗(yàn)中選擇加入pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液。

2.2.2 AlCl3溶液用量 黃酮類化合物與鋁離子可生成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物。本實(shí)驗(yàn)考察了AlCl3的用量。實(shí)驗(yàn)表明，用0.1 mol/LAlCl3溶液加入1～3 mL為宜，本實(shí)驗(yàn)選擇AlCl3的加入量為2 mL。

2.2.3 靜置時(shí)間 將溶液靜置于室內(nèi)避免陽(yáng)光直射處，并控制不同時(shí)間測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度（每10 min測(cè)1次），其熒光強(qiáng)度變化情況如圖3所示。從圖3可以看出，溶液熒光強(qiáng)度在100 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.2.4 表面活性劑 在熒光的分析中，表面活性劑對(duì)熒光強(qiáng)度有增敏、增穩(wěn)作用。本實(shí)驗(yàn)考察了5種表面活性劑吐溫-80、十六烷基溴化銨、Op-10、十二烷基磺酸鈉和氯代十四烷基吡啶對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，Op-10、十六烷基溴化銨、十二烷基磺酸鈉和氯代十四烷基吡啶對(duì)本實(shí)驗(yàn)中熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果影響不大，吐溫-80使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但其本身也產(chǎn)生強(qiáng)熒光，對(duì)測(cè)定發(fā)生干擾，所以，本實(shí)驗(yàn)不加表面活性劑。

2.2.5 常見的金屬離子對(duì)測(cè)定的干擾 結(jié)果表明，加入 100 倍的 K+，Na+，Ca+，Mg2+等陽(yáng)離子對(duì)總黃酮的測(cè)定無(wú)影響；100倍的Ba2+對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定的影響，100倍的Fe3+對(duì)測(cè)定的干擾較大。

2.3 校準(zhǔn)曲線及方法的檢出限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁為0～0.04 mg/mL時(shí)，具有良好的線性回歸方程，即y=216.63x+137.93。式中，y表示熒光強(qiáng)度，x表示蘆丁的質(zhì)量濃度（mg/mL），相關(guān)系數(shù)r=0.9997，熒光強(qiáng)度與相應(yīng)的質(zhì)量濃度線性顯著相關(guān)。對(duì)空白對(duì)照液進(jìn)行11次平行測(cè)定，根據(jù)公式CL=3S/K計(jì)算，熒光光度法的檢出限為1.08×10-9mol/L。

2.4 樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了玉米須中總黃酮含量，并對(duì)樣品溶液進(jìn)行平行測(cè)定（n=6），結(jié)果如表1所示。

表1 玉米須中總黃酮含量

由表2可知，用熒光分析法測(cè)定玉米須中總黃酮含量的平均回收率為98.3%～100.8%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該方法可行。

表2 樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

熒光光度法測(cè)定玉米須中總黃酮含量，檢出限達(dá)到1.08×10-9mol/L。該方法靈敏度高，其準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、穩(wěn)定性均能達(dá)到科研和生產(chǎn)的要求，操作簡(jiǎn)便，可廣泛應(yīng)用于植物中總黃酮的測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光度法測(cè)定玉米須中總黃酮的含量，考察了pH值、AlCl3用量、靜置時(shí)間、表面活性劑以及干擾因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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