治萎防變膠囊對(duì)CAG模型大鼠血漿ET-1含量和胃組織氧自由基域的影響*

成映霞，段永強(qiáng)，朱立鳴，李萬義

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是消化系統(tǒng)疾病治療中的難點(diǎn)之一，屬于癌前病變。老年CAG特別是CAG伴腸上皮化生和異常增生者，其胃癌發(fā)生率高達(dá)10%［1］，而內(nèi)皮素異常增高、自由基損傷在胃黏膜炎癥、萎縮病變中具有重要的誘導(dǎo)作用［2、3］。治萎防變膠囊是基于臨床效方而研制的療效確切的醫(yī)院制劑，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)觀察治萎防變膠囊對(duì)CAG大鼠血漿ET-1含量和胃組織氧自由基域的影響，探討其防治CAG的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物造模與分組

采用Wistar大鼠 90只，體重 180g±20g，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)動(dòng)物合格證號(hào) SCXK［甘］2004-0006-0000202。

除空白對(duì)照組10只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠氣虛血瘀型CAG造模參照陸為民方法［4］:(1)用滅菌水將甲基硝基亞硝基胍(N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)配成 0.1mg∕ ml濃度給大鼠自由飲用(避光)，每日配制1次;(2)采用饑飽失常喂養(yǎng)法:2d足量喂養(yǎng)，1d禁食;(3)鹽酸雷尼替丁膠囊按每天0.03g/kg灌胃，每日1次。綜合造模60d后，每隔1周殺檢大鼠，取胃黏膜做病理檢查判定腸化生的情況，至第12周大鼠胃黏膜腸化生形成后開始治療。將CAG大鼠按體重編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、治萎防變(Zhiweifangbian，ZWFB)大劑量組、ZWFB中劑量組、ZWFB小劑量組和維酶素組，每組9只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

灌胃給藥治療共90d?？瞻讓?duì)照組、模型組給予同體積蒸餾水灌胃;ZWFB大、中、小劑量組分別給予 0.6g·kg－1·d－1、0.3g·kg－1·d－1和 0.15g·kg－1·d－1ZWFB藥劑灌胃(相當(dāng)于 60kg成人劑量的10倍、5倍和 2倍);給予對(duì)照組 0.25g·kg－1·d－1維酶素灌胃(相當(dāng)于60kg成人劑量的5倍)，等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算［5］。塊的冷水中)，后以 3500r/min離心10min，取上清液置4℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.2 試劑與儀器

治萎防變膠囊，批號(hào)061208(甘肅中醫(yī)學(xué)院附院制劑室制備，0.4g/粒);維酶素，批號(hào)060407(山東魯北藥業(yè)有限公司，0.2g/片);考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，批號(hào)20071119;脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxidation，LPO)試劑盒，批號(hào) 20071120;丙二醛(Malondialdehyhe，MDA)試劑盒，批號(hào) 20071118;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號(hào)20071120;谷胱甘肽-過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)試劑盒，批號(hào) 20071120(南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所);內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)放免試劑盒，批號(hào)20071119(北京北方生物技術(shù)研究所);甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，批號(hào) 68051，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品;鹽酸雷尼替丁膠囊，批號(hào)0611025(江西匯仁藥業(yè)有限公司);DF110型電子分析天平;721型可見光分光光度計(jì);XYJ80-2離心機(jī);HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱;FT-630G微機(jī)多探頭r計(jì)數(shù)器;KDC-2044低速冷凍離心機(jī)。

所有數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間樣本均數(shù)差異的比較選用F檢驗(yàn)，在F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿ET-1含量的比較

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠血漿ET-1計(jì)數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組血漿ET-1計(jì)數(shù)水平降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血漿ET-1含量比較(珋x±s)

1.3 標(biāo)本采集

CAG造模成功并治療后，各組動(dòng)物于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，測(cè)體重做記錄后用烏拉坦1.5g/kg腹腔注射麻醉并取材。

股動(dòng)脈取血2ml注入含10%EDTA二鈉3μl和抑肽酶 40μl的試管中，混勻，3000r/min離心10min，取血漿，置于－20℃冰箱保存待檢ET-1。

胃組織勻漿制備:采血后斷頭處死，低溫條件下快速剖取胃組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰

2.2 各組大鼠胃組織SOD活性和MDA含量比較

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃組織SOD計(jì)數(shù)水平降低，MDA計(jì)數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組SOD計(jì)數(shù)水平升高，MDA計(jì)數(shù)水平升降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)。

表2 各組大鼠胃組織SOD活性和MDA含量比較(珋x±s)

2.3 各組大鼠胃組織GSH-Px活性和LPO含量比較

表3顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃組織GSH-Px計(jì)數(shù)水平降低，LPO計(jì)數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組GSH-Px計(jì)數(shù)水平升高，LPO計(jì)數(shù)水平升降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)。

表3 各組大鼠胃組織GSH-Px活性和LPO含量比較(珋x±s)

3 討論

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)“痞滿”、“胃脘痛”范疇，其病機(jī)特點(diǎn)為氣血兩虛、瘀血內(nèi)停的虛實(shí)夾雜之癥，其中血瘀是CAG的主要病理基礎(chǔ)。因本病病程遷延，反復(fù)難愈，病變由氣入血、由經(jīng)入絡(luò)，又易導(dǎo)致因虛致瘀的病理改變，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“胃黏膜血循環(huán)障礙”的認(rèn)識(shí)相一致［6］。

內(nèi)皮素(ET)是一種強(qiáng)力血管收縮因子。近年發(fā)現(xiàn)，胃腸黏膜上皮可產(chǎn)生ET，并認(rèn)為是胃黏膜損傷作用最強(qiáng)的內(nèi)源性遞質(zhì)，多種原因誘發(fā)的胃黏膜損傷均能使 ET 水平升高［7］。據(jù)報(bào)道［8］，CAG 患者胃黏膜血流量(Gastric mucosal blood flow，GMBF)較非萎縮性胃炎明顯降低，推測(cè)GMBF降低是CAG發(fā)病的重要因素之一，由于胃黏膜血液供應(yīng)減少，胃黏膜容易受損，促進(jìn)腺體萎縮。研究結(jié)果表明［9］，ET參與了CAG的病變進(jìn)程，其含量的變化與萎縮的程度有關(guān)。由此可見，胃黏膜血流量的降低是導(dǎo)致萎縮性胃炎的主要原因之一。ET-1為ET的異體之一，具有強(qiáng)烈的血管收縮作用，對(duì)胃黏膜的損傷作用已為許多研究確認(rèn)。在動(dòng)物模型中，藥物等［10、11］誘發(fā)胃黏膜損害時(shí)，血漿或胃黏膜內(nèi)ET-1濃度均有升高，而ET-1含量的升高會(huì)導(dǎo)致胃黏膜血流量降低，提示ET-1在動(dòng)物胃黏膜損害的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

近年來，關(guān)于氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)在胃黏膜致炎、致癌致突變方面的研究日益重視，由于ROS作用于生物膜上不飽和脂肪酸可產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物(LPO)，進(jìn)一步導(dǎo)致胃黏膜炎癥、萎縮甚至異形增生發(fā)生。研究表明，大鼠受MNNG攻擊的早期反應(yīng)主要是過氧化反應(yīng)增強(qiáng)［12］，蓄積在體內(nèi)的自由基(Free radicals，F(xiàn)R)可以攻擊脂類、蛋白質(zhì)、核酸，而由磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)合生成的脂蛋白為主要成分的生物膜極易受到FR的攻擊，生物膜的磷脂由于自由基反應(yīng)，而生成脂質(zhì)過氧化物L(fēng)PO并在脂質(zhì)過氧化的同時(shí)還可引起新的FR生成。LPO可分解成MDA，而 MDA、LPO易與膜蛋白、膜脂上的–NH2交聯(lián)形成mchiff's堿，使生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低了膜的流動(dòng)性，使膜功能降低甚至喪失，影響到整個(gè)細(xì)胞代謝功能、結(jié)構(gòu)的改變，從而引起細(xì)胞的老化、死亡。SOD、GSH-Px是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中最重要的酶類，在胃壁細(xì)胞內(nèi)活性很高，其作用的重要意義在于清除H2O2和OH的前身，從而保護(hù)細(xì)胞不受毒性FR的損傷。

治萎防變膠囊主要由人參、枳實(shí)、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥物經(jīng)過提取、分離而組成，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎?，F(xiàn)代藥理研究證明，人參［13］、枳 實(shí)［14］、白 術(shù)［15］、半 夏［16］、白 花 蛇 舌草［17］、三七［18］所含有效成分具有不同程度改善胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)、解痙鎮(zhèn)痛、抗自由基損傷、抑制血小板聚集、抑殺幽門螺桿菌以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤的作用。

本研究觀察到，與空白組比較，模型組大鼠血漿ET-1含量顯著升高;胃組織 GSH-Px、SOD活性顯著降低，MDA、LPO含量顯著升高，說明CAG狀態(tài)下所造成的胃損傷已影響到機(jī)體黏膜組織的血循環(huán)和氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡。而CAG造模成功并經(jīng)藥物治療后，治萎防變膠囊能顯著降低血漿ET-1含量，顯著提高胃組織 GSH-Px、SOD活性，顯著降低MDA、LPO含量，且以治萎防變膠囊大劑量作用顯著，說明治萎防變膠囊具有增加胃黏膜血流量，改善微循環(huán)和提高機(jī)體抗氧化酶活性，減輕自由基損傷并抑制脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，從而拮抗胃黏膜發(fā)生炎癥、萎縮的作用。

［1］ 董曉蕾.老年慢性萎縮性胃炎的宏觀與微觀辨證［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，28(4):7-8.

［2］ Sakai H，Ohira Y，Tanaka A，Suzuki T，Ikari A，Morii M，Takeguchi N.Inhibition of small-conductance Cl-channels by the interleukin-1beta-stimulated production of superoxide in rabbit gastric parietal cells［J］.J Physiol，2003，55(1):207-217.

［3］ 李佃貴，李瑞東，王靜，等.胃痛寧膠囊對(duì)胃潰瘍大鼠胃組織形態(tài)及血清 NO、血漿 ET、PAF含量的影響［J］.中成藥，2006，28(2):270-272.

［4］ 陸為民，單兆偉，吳靜，等.大鼠慢性萎縮性胃炎癌前病變氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研制［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，16(3):156-158.

［5］ 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993.33-34.

［6］ 張彩，丁濤，李赫楠，等.解毒活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性萎縮性胃炎大鼠血漿 ET-1的影響［J］.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，23(3):9-10.

［7］ 朱金照，內(nèi)皮素在消化性潰瘍發(fā)病中的作用［J］.Journal of Postgraduates of Medicine，2002，25(12):52-53.

［8］ 張玉，林庚金，金惠銘，等.慢性萎縮性胃炎胃黏膜血流量的研究［J］.中華消化雜志，1997，14(2):101.

［9］ 郭德忠.血漿內(nèi)皮素和降鈣素與高原地區(qū)慢性萎縮性胃炎的相關(guān)性研究［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(1):20-22.

［10］ SLOMIANY BL，SLOMIANY A.Nonsteroidal antiinflammatory drugsimpairoral mucosal repair byeliciting disturbances inendothelin -converting enzyme -1 and constitutive nitric oxidesynthase［J］.J Physiol Pharmacol，2001，52(1):81-92.

［11］ 寇庚，李兆申.內(nèi)皮素與胃黏膜損傷［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·消化系統(tǒng)分冊(cè)，2000，20(1):9.

［12］ 廖惠珍，謝炳林，徐蘊(yùn)芹.大鼠受MNNG攻擊的早期反應(yīng)及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)作用探討［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào)，1995，14(3):185-186.

［13］ 黎陽，張鐵軍，劉素香.人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40(1):164-165.

［14］ 朱玲，楊峰.枳實(shí)的藥理研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，32(2)64-66.

［15］ 宿廷敏，王敏娟，阮時(shí)寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述［J］.貴陽學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，3(2):32-34.

［16］ 李麗，王慧娟，蓋成萬.半夏的藥理和臨床研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2006，23(5):38-39.

［17］ 黃建榮，劉詠海，喻志標(biāo).白花蛇舌草化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展［J］.中成藥，2005，27(11):1329-1331.

［18］ 馮陸冰，潘西芬，孫澤玲.三七的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥師，2008，11(10):1185-1186.