骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠80%肝切除后殘肝再生及修復(fù)作用的研究*

龔慧賓 沈中陽(yáng) 宋紅麗 鄭衛(wèi)萍 董 沖 宋曉靜 張 靜

肝移植目前已被公認(rèn)為是治療各種終末期肝病的有效手段，但供體的短缺影響了肝移植的進(jìn)程，活體肝移植為終末期肝病患者帶來(lái)了希望，尤其是成人右半肝活體肝移植擴(kuò)大了供肝體積，從而減少了因供肝體積不足帶來(lái)的問(wèn)題[1]。然而供體殘肝體積不足導(dǎo)致的肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)很大，其中肝細(xì)胞損傷及再生延遲是影響活體肝移植療效的重要因素之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mes?enchymal stem cells，BMSCs）具有向肝細(xì)胞分化的潛能和自我更新能力，是目前細(xì)胞治療組織工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究BMSCs是否能促進(jìn)擴(kuò)大肝葉切除后殘肝的肝細(xì)胞再生及修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 提取BMSCs的大鼠為：4～5周齡SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120 g。動(dòng)物模型用大鼠為：6～8周齡SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g。均購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 二甲基亞砜和胰蛋白酶（Sigma公司），培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），Percoll淋巴細(xì)胞分離液（Amersham Bioscience公司）。小鼠抗大鼠的CD34-PE、CD44-PE、CD90-FIT、CD29-FITC抗體和細(xì)胞周期試劑盒（BD公司）。增殖細(xì)胞核抗原（prolifera?tion cell nuclear antigens，PCNA）免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），Beckman全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs的提取、純化及鑒定 （1）BMSCs的提取和純化：5%水合氯醛腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡3 min，無(wú)菌環(huán)境下取脛骨和股骨，原代培養(yǎng)用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞懸液以1∶1的比率覆蓋于密度為1 073 g/L的Percoll淋巴細(xì)胞分離液上層，離心收集中間白膜層細(xì)胞，PBS液洗2遍，用含10%胎牛血清DMEM/F12重懸。以1×108/L細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，48 h首次換液，待細(xì)胞接近融合80%時(shí)加入0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2傳代。通過(guò)貼壁培養(yǎng)方法，每次換液棄除懸浮細(xì)胞，從而使BMSCs得到純化。（2）BMSCs的鑒定：取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度為5×109/L，分別加入5 μL的抗體CD34、CD44、CD90及CD29，同時(shí)用PBS作為陰性對(duì)照，冰浴30 min后，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。表達(dá)CD90、CD29及CD44而不表達(dá)CD34者為BMSCs。

1.2.2 80%肝切除大鼠模型的建立 取36只雄性Wistar大鼠，半開(kāi)放式乙醚吸入麻醉，上腹橫切口入腹，離斷鐮狀韌帶、左三角韌帶及肝胃韌帶，采用中線3-0線雙線結(jié)扎法分別結(jié)扎左葉、中葉以及尾狀葉，以減少術(shù)中出血。留右葉和三角葉，即為80%肝切除手術(shù)[4]，術(shù)中注意止血徹底。

1.2.3 細(xì)胞移植 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的大鼠存活率選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的例數(shù)，以確保術(shù)后存活各個(gè)時(shí)間段的大鼠數(shù)量一致，將80%肝切除模型大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組（n=16）和對(duì)照組（n=20），實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后即刻取預(yù)先消化的BMSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108/L，用肝素化的1 mL注射器取1 mL細(xì)胞懸液經(jīng)門(mén)靜脈注射，對(duì)照組給予等量無(wú)菌生理鹽水，分別于術(shù)后1、3及7 d各處死5只，留取血液和肝組織。

1.2.4 肝細(xì)胞增殖方法及結(jié)果判定 （1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)：取部分新鮮肝臟組織研磨，透過(guò)200目濾網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞周期試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、上機(jī)，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，比較S期細(xì)胞所占比例。（2）免疫組化法：觀察PCNA的表達(dá)水平，計(jì)算PCNA指數(shù)具體方法為每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)視野，光鏡400倍下計(jì)數(shù)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[5]，PCNA指數(shù)=PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/全部肝細(xì)胞數(shù)（每個(gè)視野）×100%。

1.2.5 肝細(xì)胞修復(fù)相關(guān)檢測(cè) （1）生化檢測(cè)：分別檢測(cè)血清中的谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。（2）組織HE染色：HE染色觀察肝臟組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部數(shù)據(jù)處理均以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察：剛接種的細(xì)胞鏡下呈大小較均一的圓形，胞膜清晰，胞體透亮。接種48 h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，貼壁生長(zhǎng)的BMSCs散在分布，開(kāi)始呈圓形，部分細(xì)胞有偽足伸展，呈橢圓形、紡錘形、梭形或多角形。8～10 d后80%以上細(xì)胞融合。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，約6 d細(xì)胞融合，見(jiàn)圖1。（2）表型鑒定：75.36%的細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44及CD90，不表達(dá)CD34，為BMSCs，見(jiàn)圖2。

圖2 BMSCs的鑒定

2.2 生存率比較 實(shí)驗(yàn)組80%肝切除術(shù)后生存15只，1只死于感染；對(duì)照組生存15只，5只均在術(shù)后24 h內(nèi)死亡，死因主要是感染（1只）、彌漫性腸系膜下出血（1只）、腹水（2只）和膽汁淤積（1只）。

2.3 肝組織HE染色 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、3和7 d時(shí)肝臟組織顯示肝竇輕度擴(kuò)張，較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少見(jiàn)壞死，壞死程度明顯輕于對(duì)照組，術(shù)后3 d差異尤為明顯；對(duì)照組術(shù)后3 d，肝臟組織HE染色可見(jiàn)肝竇擴(kuò)張明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量片狀壞死，細(xì)胞氣球樣變，見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠80%肝切除術(shù)后3 d時(shí)肝臟病理改變（HE×400）

2.4 BMSCs對(duì)肝功能的影響 大鼠80%肝切除術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALT、AST水平于術(shù)后1 d達(dá)最高峰，以后逐漸下降，但實(shí)驗(yàn)組下降水平明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、3和7 d時(shí)ALT、AST水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.5 BMSCs對(duì)殘肝細(xì)胞周期的影響 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7 d時(shí)G0/G1期和術(shù)后3 d時(shí)G2/M期細(xì)胞所占比例均低于對(duì)照組，術(shù)后1、3和7 d時(shí)S期細(xì)胞所占比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.6 BMSCs對(duì)細(xì)胞增殖的影響 術(shù)后3 d實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞PCNA水平達(dá)高峰，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后不同時(shí)間PCNA表達(dá)水平高于對(duì)照組（均P＜0.01），見(jiàn)圖4、表3。

表12 組術(shù)后不同時(shí)間ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

表12 組術(shù)后不同時(shí)間ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，表2、3同

組別 ALT術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t 2 270.05±209.37 1 248.07±149.13 4.346＊＊560.90±26.25 157.17±15.56 3.086＊110.17±19.97 41.25±8.27 4.632＊＊組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t AST術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 1 670.67±230.14 747.35±140.14 3.841＊＊633.57±80.07 279.50±29.95 3.812＊＊281.12±39.62 103.87±16.67 3.943＊＊

表2 2組術(shù)后不同時(shí)間細(xì)胞周期的變化（n=5，%，±s）

表2 2組術(shù)后不同時(shí)間細(xì)胞周期的變化（n=5，%，±s）

組別 G0/G1期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t 64.45±15.13 56.72±10.76 1.040 51.83±10.76 63.45±5.82 0.836 68.36±25.09 56.93±7.66 3.011＊組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t G2/M期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 28.29±14.32 33.33±9.72 0.554 39.66±3.81 19.46±3.78 7.720＊＊28.20±17.00 33.33±7.76 0.518組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t S期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 3.45±1.87 9.75±0.10 3.680＊＊7.24±0.83 11.22±1.20 5.116＊＊8.51±0.42 16.47±3.64 5.429＊＊

表3 2組術(shù)后不同時(shí)間殘肝組織PCNA水平變化（n=5，%，±s）

表3 2組術(shù)后不同時(shí)間殘肝組織PCNA水平變化（n=5，%，±s）

組別 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t 24.62±2.92 13.42±0.55 7.515＊＊56.65±7.48 30.25±2.58 6.665＊＊7.42±1.60 3.55±0.75 6.468＊＊

3 討論

小肝綜合征是一種發(fā)生在擴(kuò)大肝切除或減體積肝臟移植后的臨床綜合征。Heaton[6]對(duì)因部分肝臟移植或由于腫瘤行擴(kuò)大肝葉切除術(shù)后小肝綜合征定義為：由于植入的肝臟體積或擴(kuò)大肝葉切除后殘肝體積過(guò)小而導(dǎo)致功能上不能滿足受體的需求，從而出現(xiàn)的一種臨床綜合征。其臨床表現(xiàn)為：術(shù)后持續(xù)性膽汁淤積、凝血機(jī)制紊亂、門(mén)靜脈高壓、腹水、持續(xù)性肝臟功能異常、膿毒血癥、胃腸出血等并發(fā)癥。組織學(xué)特征為：肝細(xì)胞呈氣球樣變、脂肪變性，膽汁瘀積形成膽栓，缺血性斑片狀壞死區(qū)和增生區(qū)并存。部分肝臟移植物或擴(kuò)大肝葉切除后殘肝可以通過(guò)肝細(xì)胞再生的方式滿足所需要的體積，但是在肝臟再生之前，殘肝體積＜35%時(shí)術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的可能性很大。在臨床上，出于對(duì)供體安全的考慮，多數(shù)供者只能提供有限體積移植肝臟，即所謂的小體積移植物，而對(duì)于肝臟腫瘤的患者，大多數(shù)已經(jīng)存在肝硬化的基礎(chǔ)病變，同樣不能耐受擴(kuò)大肝葉的切除手術(shù)，這種矛盾是導(dǎo)致小肝綜合征發(fā)生的重要原因[7]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建80%肝切除大鼠模型，通過(guò)門(mén)靜脈注射BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs能顯著促進(jìn)肝再生及修復(fù)，其機(jī)制可能與BMSCs與肝再生關(guān)系密切有關(guān)。BMSCs是一種比較原始的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，具有能夠自我更新和多向分化的潛能[8]，在適宜的條件下可被誘導(dǎo)分化成各種組織細(xì)胞，包括肝細(xì)胞[9]。BMSCs具有基質(zhì)細(xì)胞的特性，能夠分泌各種細(xì)胞因子，促進(jìn)肝再生[10-11]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門(mén)靜脈途徑注射BMSCs能顯著改善急性肝損傷小鼠肝功能[12]。

大鼠70%肝切除術(shù)后7 d殘肝再生可恢復(fù)到正常大小，出現(xiàn)小肝綜合征的比率低[13]，切除90%為極限體積，術(shù)后平均生存時(shí)間僅12 h[14]，無(wú)法觀察BM?SCs對(duì)小體積殘肝的修復(fù)和再生作用，故本實(shí)驗(yàn)選擇80%肝切除模型。

本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs作用于80%肝切除大鼠后，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段血ALT、AST水平明顯低于對(duì)照組，提示BMSCs能促進(jìn)肝功能恢復(fù)；細(xì)胞增殖周期中S期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，說(shuō)明肝細(xì)胞再生快于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞PCNA水平于術(shù)后3 d達(dá)高峰，隨后逐減低。實(shí)驗(yàn)組1、3和7 d時(shí)PCNA表達(dá)水平均明顯增高，提示BMSCs能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖?？傊?，BMSCs可以促進(jìn)大鼠80%肝切除肝再生及修復(fù)，提高生存率。

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