復(fù)方甘草酸苷、地塞米松對(duì)毛乳頭細(xì)胞活性影響的研究*

張國(guó)強(qiáng) 程 毅 李 玲 高順強(qiáng)

近年來(lái)，復(fù)方甘草酸苷被廣泛用于皮膚病和肝病的治療，臨床研究顯示復(fù)方甘草酸苷對(duì)斑禿治療有效[1-2]。糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于斑禿治療已有60余年，是目前治療斑禿最為常用、可靠及有效的方法之一，2種藥物的主要機(jī)制可能與抗炎及免疫抑制有關(guān)。本研究旨在觀察復(fù)方甘草酸苷和地塞米松對(duì)人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為臨床篩選刺激毛囊及毛發(fā)生長(zhǎng)的藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）標(biāo)本來(lái)源：正常人頭皮取自我院2009—2010年神經(jīng)外科手術(shù)患者，年齡20～40歲，無(wú)系統(tǒng)性疾病，頭皮標(biāo)本離體6 h以內(nèi)。（2）主要試劑和儀器：分離酶、膠原酶D、L-谷氨酰胺、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neomarker公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料有限公司，復(fù)方甘草酸苷購(gòu)自日本美能發(fā)源制藥公司，地塞米松購(gòu)自鄭州卓峰制藥有限公司。倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自鄭州博塞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng) 人毛乳頭細(xì)胞采用兩步酶消化分離法[3],分離得到純化的人毛乳頭細(xì)胞加含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基混勻后，以每培養(yǎng)瓶30～50個(gè)毛乳頭的密度接種。待毛乳頭貼壁后換液，去除未貼壁的單個(gè)細(xì)胞及雜質(zhì)。分離出的毛乳頭3 d后90%貼壁，貼壁1 d后可觀察到細(xì)胞遷出呈放射狀生長(zhǎng)，2～3周后細(xì)胞大部分生長(zhǎng)融合。

1.2.2 毛乳頭細(xì)胞的鑒定 取第2代毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰酶消化、傳代至放有蓋玻片的6孔板，5%CO2溫箱37℃孵育24 h，收取蓋玻片，4%多聚甲醛固定15 min，4℃過(guò)夜。用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單抗作為一抗對(duì)毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行染色，按S-P法介紹的步驟進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，胞漿出現(xiàn)黃色顆粒為(+)，棕色顆粒為(++)，褐色顆粒為(+++)。

1.2.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)藥物對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代人毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以105的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后吸取培養(yǎng)基，設(shè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為復(fù)發(fā)甘草酸苷組和地塞米松組，實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度藥物(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100 mg/L)的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組只加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg/L的MTT 10 μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，避光條件下充分震蕩，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)492 nm處測(cè)定各孔吸光度值(A492)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，多個(gè)樣本兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白在人毛乳頭細(xì)胞中為陽(yáng)性表達(dá)，呈細(xì)絲狀沿細(xì)胞長(zhǎng)軸分布，見(jiàn)圖1。

圖1 人毛乳頭細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)（免疫組化×200）

2.2 藥物干預(yù)對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 （1）復(fù)方甘草酸苷干預(yù)結(jié)果：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代毛乳頭細(xì)胞加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷培養(yǎng)72 h后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異。MTT結(jié)果顯示各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.627，P＜0.05），與對(duì)照組相比，10、20、50 mg/L均能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P分別為0.025、0.002、0.003）。在0.5～20 mg/L濃度范圍內(nèi)，促增殖作用逐漸增強(qiáng)，濃度再增加，其促增殖作用反而減弱，見(jiàn)圖2。（2）地塞米松干預(yù)結(jié)果：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代毛乳頭細(xì)胞加入不同濃度的地塞米松培養(yǎng)72 h后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異。MTT結(jié)果顯示各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.045，P＜0.05），與對(duì)照組相比，1、2.5 mg/L均能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P分別為0.004和0.001）。在0.5～2.5 mg/L濃度內(nèi)，促增殖作用逐漸增強(qiáng)，濃度再增加，其促增殖作用有所減弱，見(jiàn)圖3。在倒置顯微鏡下觀察經(jīng)2種藥物處理的細(xì)胞，復(fù)方甘草酸苷組較地塞米松組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，胞漿更為豐富。

圖2 不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

圖3 不同濃度地塞米松對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

3 討論

甘草是傳統(tǒng)中藥養(yǎng)發(fā)生發(fā)產(chǎn)品中使用頻率較高的藥物和添加成分，復(fù)方甘草酸苷的主要成分為甘草酸苷，即β-甘草酸，并復(fù)方了甘氨酸及半胱氨酸（片劑為蛋氨酸），具有多種藥理作用。因其具有抗超敏反應(yīng)、抗炎癥的作用，在皮膚科領(lǐng)域常被用于治療多種過(guò)敏性皮膚疾病，近來(lái)多項(xiàng)臨床研究顯示其對(duì)斑禿治療有效[1-2]，且體外毛囊培養(yǎng)證明甘草提取物對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[4]。糖皮質(zhì)激素給藥方法有外用、局部注射和系統(tǒng)給藥，其作用機(jī)制主要與抗炎及免疫抑制有關(guān)，其中局部注射是較為安全有效的方法之一，該法在國(guó)外通常作為局限性斑禿治療的首選[5]，并且在美國(guó)皮膚病學(xué)委員會(huì)指南報(bào)告中被列為斑禿的首選治療方案[6]。以往對(duì)這2種藥物作用于斑禿作用機(jī)制的研究大都集中在其抗炎、免疫抑制方面。Thornton等[7]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素作用于毛乳頭細(xì)胞的機(jī)制與雌激素及其β受體有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，斑禿患者皮損部位的毛囊總數(shù)減少，生長(zhǎng)期毛囊則明顯減少甚至消失，多數(shù)毛囊為退行期、休止期改變，毛乳頭縮小、消失[8]。本研究表明復(fù)方甘草酸苷和地塞米松分別能在一定濃度范圍內(nèi)刺激毛乳頭細(xì)胞增殖。2種藥物在抗炎、免疫調(diào)節(jié)的同時(shí)還可能調(diào)節(jié)了毛乳頭細(xì)胞的活性，進(jìn)而通過(guò)多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7等，調(diào)節(jié)毛囊上皮細(xì)胞，并促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞增殖分化，最終誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)[9]，提示尋找能夠增強(qiáng)毛乳頭細(xì)胞活性的藥物將是治療各類脫發(fā)性疾病的又一切入點(diǎn)。在倒置顯微鏡下可見(jiàn)復(fù)方甘草酸苷處理的細(xì)胞較地塞米松生長(zhǎng)狀態(tài)好，胞漿更為豐富。推測(cè)在治療脫發(fā)性疾病方面，復(fù)方甘草酸苷可能較傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素更有優(yōu)勢(shì)。

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