應(yīng)用rep-PCR分型技術(shù)篩選潛在治療性乳桿菌

王江，張瑞芬，周莉，蘇小虎，胡春紅，王萌，向陽，楊毅，朱寶利，馮濤

1 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016

2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

3 惠斯康健康科技 (北京) 有限公司，北京 100086

4 中國科學(xué)院大氣物理研究所醫(yī)務(wù)室，北京 100029

5 衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科生化室，北京 100730

6 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100005

陰道細(xì)菌種類的變化與婦女和胎兒的健康密切相關(guān)，陰道的有益菌和條件致病菌在種類和數(shù)量上基本恒定，共同維持陰道微生態(tài)平衡[1]。其中，乳酸桿菌是維持陰道正常微生態(tài)環(huán)境最常見和最重要的有益菌[2]，在陰道微生態(tài)環(huán)境中占到 95%，而主要的乳酸桿菌占到50%~80%[3-4]，它分解陰道粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)的糖原產(chǎn)生乳酸和過氧化氫，使陰道保持酸性環(huán)境 (pH值為 3.8~4.2)，陰道的酸性環(huán)境和過氧化氫對抑制條件致病菌的侵入和生長具有重要的防御作用[3]。

細(xì)菌性陰道病是育齡期婦女最為常見但又未受重視的多細(xì)菌感染性疾病，以明顯的陰道微生態(tài)環(huán)境紊亂，乳桿菌優(yōu)勢地位被大量厭氧菌群替代為主要特征[5]。細(xì)菌性陰道病是“小疾病，大麻煩”，患者感染艾滋病和淋病的危險性明顯增加；妊娠婦女易出現(xiàn)妊娠并發(fā)癥，如早產(chǎn)及絨毛膜羊膜炎等。由于抗生素治療細(xì)菌性陰道病效果欠佳，復(fù)發(fā)率高達(dá)50%以上[6]，因此，調(diào)節(jié)乳桿菌制劑的研究日益引起人們的重視，國內(nèi)外一直在努力研制試圖開發(fā)一種乳桿菌生態(tài)制劑，在利用抗生素清除致病菌后，直接補(bǔ)充陰道內(nèi)正常生理細(xì)菌，調(diào)節(jié)陰道內(nèi)菌群平衡。

目前，我國已有乳酸桿菌制劑產(chǎn)品定菌生用于細(xì)菌性陰道病的治療[7]，并已經(jīng)取得了一定的療效，但尚未達(dá)到人們預(yù)期的效果，這可能與其主要成分德氏乳桿菌并非我國婦女陰道菌群中的優(yōu)勢菌群有關(guān)。近來研究提示：我國健康育齡期婦女陰道菌群的結(jié)構(gòu)相對簡單，以彎曲乳酸桿菌或惰性乳桿菌占優(yōu)勢[8-9]。不同的彎曲乳酸桿菌分離株可能存在基因型的差異，本研究旨在分離鑒定陰道彎曲乳酸桿菌并通過對其基因分型和產(chǎn)H2O2的初步研究，篩選具有防治女性生殖道感染的彎曲乳酸桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，MRS培養(yǎng)基購自美國OXID公司，Taq酶購自 TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 擴(kuò)增儀購自美國 Applied Biosystems公司；電泳儀購自美國BIO-RAD公司，凝膠成像儀購自美國Alpha Innotech公司，培養(yǎng)箱購自上海博遠(yuǎn)，酶標(biāo)儀購自美國BIO-TEK，pH計購自意大利HANNA等。

1.2 菌株

95例健康志愿者陰道分泌物，由衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科提供。樣本依次編號為 T1、T2、T3……T95，接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h[10]。每個樣本隨機(jī)挑選5個單菌落于2 mL MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)增菌24 h，菌落依次編號T1-1、T1-2、T1-3、T1-4和 T1-5，其余類推。擴(kuò)增細(xì)菌用于細(xì)菌保種與DNA制備。

1.3 rep-PCR基因分型篩選

為了避免對所有菌株進(jìn)行測序，我們首先利用rep-PCR方法對分離所得菌株進(jìn)行基因分型。擴(kuò)增引物 REP1R-Dt (3′-CGGNCTACNGCNGCNIII-5′)和REP2-Dt (3′-CATCCGGNCTATCNGCN-5′)[11]。25 μL反應(yīng)體系：1×buffer，10%二甲基亞砜，上游及下游引物各50 pmol，dNTPs各1.2 mmol/L，MgCl27 mmol/L，2.5 U Taq酶，100 ng DNA模板。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min；90 ℃變性30 s，40 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，共32個循環(huán)；65 ℃延伸16 min[12]。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測，成像、比較DNA帶型。選擇具有不同帶型的菌株做下一步的16S rRNA基因序列分析。

1.4 乳酸桿菌的鑒定

采用 27F-1492R通用引物擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA基因保守區(qū)。25 μL擴(kuò)增體系包括：1×PCR反應(yīng)緩沖液，200 μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2 μmol/L，1 U Taq DNA聚合酶，1 μL 乳桿菌基因組DNA。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢測，陽性結(jié)果送北京諾賽公司，用27F-1492R進(jìn)行雙向測序。將測序結(jié)果拼接后選取中間的 1 400 bp與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，與參考序列一致性大于 97%則將其歸為該類乳桿菌。

1.5 H2O2檢測

H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：首先用100 mmol/L 哌嗪-N,N'-二-乙磺酸 (Piperazine-N,N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES) 將30% H2O2(相當(dāng)于9.128 mol/L) 儲存液稀釋成1 mol/L，再用100 mmol/L PIPES將1 mol/L H2O2分別稀釋成 0、20、40、60、80、100 μmol/L工作液；然后分別取100 μL上述H2O2工作液與100 μL 20 mmol/L TMB (四甲基聯(lián)苯胺)、2 μL辣根過氧化物酶 (1 mg/mL) 混合，16 ℃孵育10 min，測量 OD630值。H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0033x?0.0496，R2=0.992。乳桿菌液體培養(yǎng)H2O2濃度檢測：挑取乳桿菌單菌落，接種1 mL培養(yǎng)48 h的菌液于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)21 h后，轉(zhuǎn)換為振蕩培養(yǎng)3 h，振速為220 r/min，然后12 000 r/min離心2 min，取100 μL菌液上清檢測H2O2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算H2O2濃度[13]。

1.6 pH檢測

將活化的乳酸桿菌以5%比例接種MRS培養(yǎng)基(pH 6.3) 中，37 ℃培養(yǎng)。用TECAN infinite M200酶標(biāo)儀與意大利HANNA精密酸度計每隔12 h測其OD630與 pH值，以 H+濃度與 OD630比值計算單位菌體密度產(chǎn)酸量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

實驗收集了95例樣品，其中6例培養(yǎng)失敗，剩余89例樣品經(jīng)過MRS平板培養(yǎng)，挑取445個單克隆進(jìn)行MRS液體培養(yǎng)及DNA提取；隨后rep-PCR基因分型篩選得到85個具有不同帶型的菌株；再進(jìn)一步通過16S rRNA測序比對，最后確認(rèn)65株乳酸桿菌。表1為測序分析結(jié)果，其中，L. crispatus 19株，L. jensenii 17株，L. fermentum 12株，主要菌株與文獻(xiàn)報道相符[14]。

2.2 rep-PCR基因分型帶型圖譜比較

人體陰道環(huán)境的乳酸桿菌的分布具有復(fù)雜性和多樣性，T49號陰道環(huán)境中乳酸桿菌種類單一，如圖1所示：隨機(jī)挑選的5個乳酸桿菌菌株帶型圖譜一致，說明其中主要含一種乳酸桿菌。與此不同，有的樣本分離的 5個乳酸桿菌菌株圖譜之間存在明顯差異，表現(xiàn)出不同的帶型，如圖2所示，說明T27號陰道環(huán)境中可能存在多種不同的乳酸桿菌。不同個體分離到的10株彎曲乳酸桿菌亦存在差異，其帶型存在多樣性，說明彎曲乳桿菌具有多型性，見圖3，其中 T12-1、T29-5和T37-3菌株帶型圖譜相似程度較高，關(guān)系較近。

表1 65株乳酸桿菌分布情況Table 1 Distribution of 65 Lactobacillus isolates

2.3 產(chǎn)酸與產(chǎn)H2O2的比較

圖4可見在12 h到24 h這段時間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的增加，10株彎曲乳酸桿菌單位菌體密度產(chǎn)酸量增加，變化較快；24 h到36 h時間段體密度產(chǎn)酸量變化不大，基本達(dá)到穩(wěn)定，pH值在4左右。經(jīng)方差分析，10株彎曲乳酸桿菌單位菌體密度產(chǎn)酸量無顯著差異 (F=2.44＜F0.01=2.59)。從圖5中我們可以看到，彎曲桿菌各亞型間產(chǎn)H2O2能力存在顯著差異(F=7.48＞F0.01=2.59)，其中 T22-3、T29-5菌株產(chǎn)H2O2能力明顯高于其他菌株，T6-1、T12-1、T25-3、T33-1、T35-4、T37-3產(chǎn) H2O2能力較弱，而 T27-7和T31-3菌株不產(chǎn)H2O2。為此，對于同種乳酸桿菌，我們選擇產(chǎn)H2O2能力，而不是單位菌體密度產(chǎn)酸量作為有益菌篩選指標(biāo)之一。

圖1 T49樣本乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 1 rep-PCR fingerprints of Lactobacillus strains from the sample T49. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T49-1; 3: T49-2; 4: T49-3; 5: T49-4; 6: T49-5.

圖2 T27樣本乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 2 rep-PCR fingerprints of Lactobacillus strains from the sample T27. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T27-1; 3: T27-2; 4: T27-3; 5: T27-4; 6: T27-5.

圖3 來自不同樣本的彎曲乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 3 rep-PCR fingerprints of the 10 L. crispatus isolated from different samples. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T6-1; 3: T12-1; 4: T22-3; 5: T 25-3; 6: T27-7; 7: T29-5; 8: T31-3; 9: T33-1; 10: T35-4; 11: T37-3.

圖4 10株彎曲乳桿菌產(chǎn)酸能力比較Fig. 4 Acid production of the isolated 10 L. crispatus.

圖5 10株彎曲乳桿菌產(chǎn)H2O2比較Fig. 5 Hydrogen peroxide production of the 10 L. crispatus.

3 討論

乳桿菌作為一種益生菌已廣泛應(yīng)用于胃腸道疾病的治療，Lactobacillus casei rhamnosus乳桿菌通過 Lactocin 160抑制致病菌的生長、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡起到預(yù)防腹瀉、治療便秘的作用[15]。近年來，在 BV治療方面也有較多相關(guān)報道，如德氏乳桿菌 DM8909菌株 (商品名定菌生) 已在臨床上用于BV的治療。單一菌株治療BV具有一定的局限性，研究者們還應(yīng)用多種乳桿菌聯(lián)合治療BV，將具有較強(qiáng)定植力的Lactobacillus brevis (CD2) 乳桿菌與能產(chǎn)抗菌物質(zhì)的 Lactobacillus salivarius (FV2)乳桿菌和 Lactobacillus plantarum (FV9) 乳桿菌制備成混合菌劑，取得了較好的治療效果[4]。然而，大多數(shù)菌劑的治愈率僅能達(dá)到60%~70%[7]，仍有必要繼續(xù)尋找適合我國人群的用于防治 BV的乳桿菌菌株。

本實驗首次采用了 rep-PCR技術(shù)，對健康婦女陰道內(nèi)彎曲乳桿菌種進(jìn)行了初步的基因分型。rep-PCR技術(shù)是一種分析細(xì)菌基因指紋圖譜的新方法，它是通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA 片段來獲得菌株特異性圖譜。目前，有兩種主要的重復(fù)序列片段用于該方法中，一種是基因外重復(fù)回文序列(Repetitive extragenic palindromic elements，REP)，一種是基因間重復(fù)序列 (Enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)，本實驗采用的是基因外重復(fù)序列，它是1個長為38 bp的DNA片段，由1個保守回文段及兩端分別有6個簡并位點和1個5 bp的可變框組成[16]。rep-PCR技術(shù)具有高分辨力、高通量性、重復(fù)性好、費用低等特征，是一種可靠的基因分型方法[17]。經(jīng)rep-PCR技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)正常陰道乳桿菌在不同個體的分布具有多樣性，有的婦女僅含有一種乳酸桿菌，而有的婦女具有多種乳酸桿菌；另外，彎曲乳酸桿菌種間存在多樣性，健康婦女不同個體中的彎曲乳桿菌分離株存在不同基因型，10株彎曲乳桿菌樣本帶形圖譜不相同，我們可以推測個體抵抗致病菌侵襲以及包容外源益生菌能力的強(qiáng)弱可能與乳酸桿菌種類的多樣性相關(guān)。這也能解釋單一菌株的乳桿菌治療BV療效不一。

有報道乳桿菌產(chǎn)酸、H2O2能力與其抑菌能力成正相關(guān)[18]。乳桿菌通過產(chǎn)乳酸或其他脂肪酸來維持陰道酸性環(huán)境[19-20]。H2O2通過介導(dǎo)細(xì)菌 DNA的破壞，來抑制其他細(xì)菌的生長[21]。因此，生態(tài)菌劑的開發(fā)，還必須兼顧乳桿菌產(chǎn)酸、產(chǎn)H2O2能力等一些與治療作用機(jī)理相關(guān)的理化特性。本研究表明，產(chǎn)H2O2能力在彎曲乳桿菌不同型別存在較大差別，而同種乳桿菌產(chǎn)酸能力差別不大。

總之，健康婦女陰道內(nèi)存在多種乳桿菌，且具有個體差異性，彎曲乳酸桿菌各型間產(chǎn)酸能力相差不大，而產(chǎn)H2O2能力差異明顯。彎曲乳桿菌的多樣性也為制備新型的益生菌劑提供了豐富的資源，為找到一種適用范圍廣的乳桿菌成為可能，我們可利用不同種、型間的優(yōu)勢并結(jié)合其產(chǎn)酸、產(chǎn) H2O2能力開發(fā)出一種含不同乳桿菌的混合菌劑來治療BV。選擇乳桿菌益生菌治療 BV時，需要綜合考慮陰道內(nèi)乳桿菌的分布多樣性，及其產(chǎn)酸、產(chǎn)H2O2能力，另外，還需要強(qiáng)調(diào)一點：乳桿菌與陰道上皮細(xì)胞粘附的能力與其能否在陰道成功定植有關(guān)，是乳桿菌持續(xù)作用的基礎(chǔ)，也是乳桿菌治療 BV療效的關(guān)鍵因素[22]。

[1] Donati L, Di Vico A, Nucci M, et al. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy. Arch Gynecol Obstet, 2010, 281(4): 589?600.

[2] Wilson BA, Thomas SM, Ho M. The Human Vaginal Microbiome//Metagenomics Human Body, Capter 6. Berlin: Springer-Verlag, 2011: 91?115.

[3] Xu HY, Tian WH, Wan CX, et al. Antagonistic potential against pathogenic microorganisms and hydrogen peroxide production of indigenous Lactobacilli isolated from vagina of Chinese pregnant women. Biomed Environ Sci, 2008, 21(5): 365?371.

[4] Antonio MA, Hawes SE, Hillier SL. The identification of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species. J Infect Dis, 1999, 180(6): 1950?1956.

[5] Damelin LH, Paximadis M, Mavri-Damelin D, et al. Identification of predominant culturable vaginal Lactobacillus species and associated bacteriophages from women with and without vaginal discharge syndrome in South Africa. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 2): 180?183.

[6] Kaewsrichan J, Peeyananjarassri K, Kongprasertkit J. Selection and identifcation of anaerobic Lactobacilli producing inhibitory compounds against vaginal pathogens. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 48(1): 75?83.

[7] Wang YF, Lang JH, Yuan JL, et al. The phase Ⅱ clinical trial of L. delbrueckii DM8909 in the patient with bacterial vaginosis. Chin J Microecol, 2001, 13(4): 198?201.王友芳, 郎景和, 袁杰利, 等. 德氏乳桿菌DM 8909 菌株對細(xì)菌性陰道病治療的Ⅱ期臨床試驗研究. 中國生態(tài)學(xué)雜志, 2001, 13(4): 198?201.

[8] Shi Y, Chen LQ, Tong JQ, et al. Preliminary characterization of vaginal microbiota in healthy Chinese women using cultivation-independent methods. J Obstet Gynaecol Re, 2009, 35(3): 525?532.

[9] Ling ZX, Kong JM, Liu F, et al. Molecular analysis of the diversity of vaginal microbiota associated with bacterial vaginosis. BMC Genomics, 2010, 11(488): 1471?2164.

[10] Jia SF, Wang YY, Guo XH, et al. The factors affected transformation efficiency of Lactobacillus by electroporation. Chin J Biotech, 1998, 14(4): 429?433.賈士芳, 王蔭榆, 郭興華, 等. 乳桿菌電轉(zhuǎn)化條件的研究. 生物工程學(xué)報, 1998, 14(4): 429?433.

[11] Antonio MAD, Hillier SL. DNA fingerprinting of Lactobacillus crispatus strain CTV-05 by repetitive element sequence-based PCR analysis in a pilot study of vaginal colonization. J Clin Microbiol, 2003, 41(5): 1881?1887.

[12] Versalovic J, Schneider M, De Bruijin FJ, et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods Mol Cell Bio, 1994, 5(1): 25?40.

[13] Martín R, Suárez JE. Biosynthesis and degradation of H2O2by vaginal Lactobacilli. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(2): 400?405.

[14] Matu MN, Orinda GO, Njagi ENM, et al. In vitro inhibitory activity of human vaginal Lactobacilli against pathogenic bacteria associated with bacterial vaginosis in kenyan women. Anaerobe, 2010, 16(3): 210?215.

[15] Petricevic L, Witt A. The role of Lactobacillus casei rhamnosus Lcr35 in restoring the normal vaginal flora after antibiotic treatment of bacterial vaginosis. BJOG, 2008, 115(11): 1369?1374.

[16] Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res, 1991, 19(24): 6823?6831.

[17] Gevers D, Huys G, Swings J. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species. FEMS Microbiol Lett, 2001, 205(1): 31?36.

[18] Reid G, Bruce AW, Mcgroarty JA, et al. Is there a role for Lactobacilli in prevention of urogenital and intestinal infections? Clin Microbiol Rev, 1990, 3(4): 335?344.

[19] McLean NW, Rosenstein IJ. Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis. J Med Microbiol, 2000, 49(6): 543?552

[20] Rossi A, Rossi T, Bertini M, et al. The use of Lactobacillus rhamnosus in the therapy of bacterial vaginosis. Evaluation of clinical efficacy in a population of 40 women treated for 24 months. Arch Gynecol Obstet, 2010, 281(6): 1065?1069.

[21] Holmes KK, Chen KCS, Lipinski CM, et al. Vaginal redox potential in bacterial vaginosis (nonspecific vaginitis). J Infect Dis, 1985, 152(2): 379?382.

[22] Andreu A, Stapleton AE, Fennell CL, et al. Hemagglutination, adherence, and surface properties of vaginal Lactobacillus species. J Infect Dis, 1995, 171(5): 1237?1243.