PTEN、MRP在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及生物學(xué)意義

翟展藝 蔣軍廣 翟建霞 田 蕊 趙 娜

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

肺癌發(fā)病率及死亡率在近10年來呈明顯上升的趨勢，60%～80%的肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期，治療多采用以化療為主的綜合治療。張力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)是一種新的多藥耐藥相關(guān)蛋白基因。有關(guān)PTEN、MRP在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用尚存在爭議。本實(shí)驗(yàn)檢測不同組織類型、分化程度、臨床分期及預(yù)后的肺癌組織標(biāo)本中PTEN、MRP的表達(dá)，旨在探討PTEN基因表達(dá)及細(xì)胞增殖凋亡在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以及MRP陽性表達(dá)與肺癌臨床病理改變之間的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 標(biāo)本 2002年9月至2006年11月在我院住院手術(shù)切除的肺癌患者 55例，男 42例，女 13例，年齡 36～81〔平均(58.93±21.96)〕歲。所有患者術(shù)前均未行放療和化療。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，鱗癌31例，腺癌24例。根據(jù)1997年國際抗癌協(xié)會提出的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，ⅠA期0例，ⅠB期11例，ⅡA期1例，ⅡB期13例，ⅢA期15例，ⅢB期12例，Ⅳ期3例。對照組選擇22例癌旁正常肺組織(距癌組織3 cm以上)。所有標(biāo)本均為甲醛固定、石蠟包埋。連續(xù)4μm厚切片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人PTEN多克隆抗體，鼠抗人MRP單克隆抗體，免疫組化法(S-P)通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用S-P法，主要步驟如下:石蠟切片脫蠟水化，于檸檬酸緩沖液中行微波抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應(yīng)，滴加兔抗人PTEN多克隆抗體，鼠抗人MRP單克隆抗體，4℃過夜，加生物素標(biāo)記的第二抗體，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.3 結(jié)果判定 PTEN蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。從以下兩方面進(jìn)行定量判斷:①陽性著色:無色為0分，淡黃色1分，棕黃色3分;②陽性細(xì)胞數(shù):5個高倍視野在每張切片上計(jì)算1 000個以上癌細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～100%為3分。兩類分?jǐn)?shù)乘積，3分以下為陰性“－”，3分為弱陽性“+”，4分以上為強(qiáng)陽性“?”。MRP蛋白以胞質(zhì)和胞膜呈棕黃色為陽性細(xì)胞。首先根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)目判斷:高倍鏡下隨機(jī)選擇腫瘤細(xì)胞密集區(qū)觀察500個瘤細(xì)胞，計(jì)算其陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比。無陽性細(xì)胞為陰性，1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤10%;2分為11% ～50%;3分為51% ～75%;4分為＞75%。再按染色強(qiáng)度計(jì)分:1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。以兩者乘積為最后得分:≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在正常肺組織及肺癌原發(fā)灶中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 23例正常肺組織中PTEN陽性表達(dá)率為86.95%(20/23)，55例肺癌組織中的陽性表達(dá)率為63.63%(35/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.242，P=0.03)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)高、中分化PTEN陽性表達(dá)率為88.57%，低分化為20.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.861，P ＜0.01)。TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期PTEN陽性表達(dá)率92.00%，Ⅲ、Ⅳ期為40.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.934，P＜0.01)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 PTEN陽性表達(dá)率50.00%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為94.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.879，P＜0.01)。PTEN的表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的臨床類型、病理類型、腫瘤大小等均無關(guān)(均P＞0.05)。

2.2 MRP在正常肺組織及肺癌原發(fā)灶中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 23例正常肺組織中陽性表達(dá)率為34.78%(8/23)，55例肺癌組織中的陽性表達(dá)率為83.63%(46/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.171，P=0.000)。鱗癌中MRP陽性表達(dá)率93.00%，腺癌中為70.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.1，P＜0.05)。PTEN的表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的臨床類型、病理類型、分化程度、TNM分期、腫瘤大小等均無關(guān)(均P＞0.05)。

3 討論

1997年發(fā)現(xiàn)的PTEN是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，該基因定位于第10號染色體q23.3，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。PTEN基因具有雙重磷酸酶的特異性，對蛋白質(zhì)去磷酸化，特異地去除PIP3上的磷酸基團(tuán)，然后分別通過抑制體內(nèi)蛋白激酶B(PKB)和抑制黏附斑激酶(FAK)途徑，對細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)〔1，2〕。PTEN還可直接抑制細(xì)胞內(nèi)PKB活性，阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞生長分化。PTEN可使FAK去磷酸化，從而抑制黏附斑復(fù)合物所介導(dǎo)的細(xì)胞浸潤、生長分化。

本研究中肺癌組織PTEN的蛋白表達(dá)顯著低于癌旁正常肺組織，肺癌PTEN表達(dá)降低，提示PTEN蛋白的低表達(dá)在肺癌的發(fā)生中可能起重要作用。PTEN蛋白陽性表達(dá)率與肺癌病理組織學(xué)類型無關(guān)，而與分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。中高分化癌陽性表達(dá)率明顯高于低分化癌，PTEN蛋白失表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PTEN表達(dá)下調(diào)與NSCLC的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔3〕，這可能與其脂質(zhì)磷酸酶活性有關(guān)，故PTEN通過使FAK去磷酸化抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔1〕。PTEN有可能成為判斷肺癌分化程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)。

MRP是由王寧〔4〕1992年在不表達(dá) P-gp的人小細(xì)胞系H69AR中分離出的一種新的耐藥基因蛋白，定位于16號染色體 p13.1，相對分子質(zhì)量為 190×103，稱 MRP。MRP與mdr/P-gp同屬ATP結(jié)合盒式蛋白(ABC)超家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是ATP依賴的跨膜蛋白〔5〕。Wright采用免疫熒光檢測肺癌組織中的MRP表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細(xì)胞膜上;同時(shí)，在正常支氣管上皮細(xì)胞及混合腺中也能見到其表達(dá)于基側(cè)膜上，表明MRP主要存在于細(xì)胞膜上，但也有少量存在于細(xì)胞質(zhì)中。MRP主要功能有兩種:①位于細(xì)胞膜發(fā)揮藥物外排泵的作用，主要通過協(xié)同機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合還原型谷胱甘肽的藥物。MRP作為一種ATP能量依賴的耦合輸出泵(GS-X)，當(dāng)抗腫瘤藥物在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的作用下與谷胱甘肽形成共軛物GS-X時(shí)，通過泵功能將GS-X迅速泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度迅速下降，產(chǎn)生耐藥。②位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成囊泡包裹藥物，起隔離作用，避免藥物損傷細(xì)胞核。本研究結(jié)果顯示，MRP在肺癌中的檢出率為83.63%，與文獻(xiàn)相符〔6〕。MRP在腺癌中的陽性表達(dá)率較鱗癌中低，提示MRP可能與NSCLC的發(fā)生及病理類型有關(guān)。

1 Tamura M，Gu J，Matsurmoto K，et al.Inhibition of cell migration.spreading and focal adhesions by tumor suppressor PTEN〔J〕.Science，1998;280(5369):1614-7.

2 Schondorf T，Becker M，Gohring UJ，et al.Interaction of cisplatin，paclitaxel and adriamycin with the tumor suppressor PTEN〔J〕.Anticancer Drugs，2001;12(10):797-800.

3 廖曉波，胡冬煦，周新民，等.利用組織微陣列結(jié)合免疫組化法研究PTEN，P16，P21，P53在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.癌癥，2004;23(3):334-8.

4 王 寧，楊海山，劉 潔，等.人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的建立及耐藥相關(guān)基因表達(dá)檢測〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005;31(3):361-4.

5 Drug D，F(xiàn)ilippov DV，Hermanns R，et al.Peptidomimetic glutathione analogues as novel gamma GT stable GST inhibitors〔J〕.Bioorg Med Chem，2002;10(1):195-205.

6 Souslova T，Averill-Bates P.Multidrug-resistant hela cells overexpressing MRP1 exhibit sensitivity to cell killing by hyperthermia:interactions with etoposide〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004;60(5):1538-51.