TMEM16A:鈣激活氯通道研究進展

劉雅妮，張海林

(河北醫(yī)科大學藥理學教研室，河北石家莊 050017)

鈣激活的氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)廣泛分布在內皮細胞、上皮細胞、甚至血細胞等非興奮細胞，及心肌細胞、神經細胞、血管平滑肌細胞等可興奮細胞。第一次發(fā)現(xiàn)CaCCs是在爪蟾的卵母細胞中［1］。胞質內鈣離子濃度(［Ca2+］i)的升高引起CaCCs的開放，使膜發(fā)生去極化，而抑制多精受精。CaCCs在許多生理活動中起重要作用，如上皮細胞的分泌、心肌和神經元的興奮、嗅覺轉導等。

由于技術上的原因，CaCCs分子基礎的問題一直未能解決，曾有報道認為CLCA、ClC-3、Bestrophins是CaCCs分子基礎的候選基因，但以上蛋白分子產生的氯離子電流都與典型的天然CaCCs通道有明顯區(qū)別。最近幾個研究小組幾乎同時報道了CaCCs的分子基礎是跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)［2－4］，這將為在特定細胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關問題及其作用機制提供新的研究平臺。

近年來研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A在非興奮性組織起源的腫瘤中高表達［5］，而在相同起源的正常組織低表達或不表達。但是TMEM16A在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。

1 CaCCs分子基礎及構效關系

1.1 分子基礎 對于CaCCs的分子基礎，曾有過幾個候選者。第一個是CLCA，它是從牛的氣管中分離得到的蛋白。編碼各種CLCA蛋白的cDNA轉染多種細胞系均能誘發(fā)鈣依賴的電流。然而，Gibson等人的研究表明CLCA蛋白是細胞粘附分子，可粘附在細胞表面或被分泌到細胞間質中。ClC-3是CaCCs的另一個候選者。但是ClC-3產生的電流缺少電壓依賴性和鈣依賴性，而CaCCs是可被鈣離子直接激活的。ClC-3還與細胞容積激活的氯通道活性有關，但是ClC-3敲除小鼠有正常的鈣離子和容積激活的氯電導。Bestrophins最初是作為卵黃斑營養(yǎng)不良的相關蛋白發(fā)現(xiàn)的，是CaCCs的另一個候選者［6］。與經典的天然CaCCs相比，bestrophins表達的氯電流對鈣離子有不同的親和力，電壓依賴性和對抑制劑的敏感性也不同。最近的研究表明，bestrophins為鈣離子通過內質網膜提供電動力［7］。

2008年，3個研究小組幾乎同時用不同方法獨立指出了TMEM16A是CaCCs的分子基礎。體內或體外TMEM16A沉默都能引起內源性CaCCs功能的抑制。另一方面，在裸細胞表達異源的TMEM16A表現(xiàn)有鈣激活氯通道生理和藥理學特征。如，TMEM16A的離子選擇性順序(NO－3＞I－＞Br－＞Cl－＞F－)與報道的內源性 CaCCs相似［8］。另外，TMEM16A表達產生的氯離子電流可被尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-(3-phenylp ropylamino)-benzoic acid，NPPB)［9］、4，4'-二異硫氰酰-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonicacid，DIDS)抑制，他們的效價與報道的 CaCCs相似［6］。而后續(xù)研究表明TMEM16A與氯通道活性相關［10］。報道的高度一致表明了TMEM16A獨立構成了CaCCs或者與其他未知蛋白共同構成了CaCCs。

1.2 構效關系 TMEM16A有8個跨膜結構域，氨基和羧基末端都在膜內。由于8個跨膜區(qū)域的拓撲結構和其在陰離子轉運中的作用，TMEM16A也叫做 ANO1(anoctamin-1)。第5、6跨膜區(qū)帶正電荷的氨基酸突變成帶負電的谷氨酸可明顯改變通道對陰陽離子的通透性，即改變通道的離子選擇性，這一實驗初步推斷第5、6跨膜區(qū)可能形成一個折返環(huán)插入質膜中，對通道孔的形成可能有貢獻［4，11］。但是，TMEM16A序列中并沒有熟知的鈣離子或鈣調蛋白結合位點，如EF手結構。如果TMEM16A可以直接結合鈣離子，那很可能是通過一個新的未知微域。膜內第一個折返環(huán)的4個緊鄰谷氨酸有可能是鈣離子結合位點。這一結構與鈣激活鉀通道的“鈣碗”相似［12］。

TMEM16A 有 4 個可選擇剪切片段 a、b、c、d，分別對應116、22、4、26 的氨基酸長度［13］。對人的不同組織器官分析TMEM16A片段結果顯示有多種表達模式。許多組織表達不同亞型:表達會跳過b或d，這一協(xié)調的模式可能說明片段b和d功能互斥［7］。相反，c片段是都有的，但在大腦和骨骼肌上也有很小的跳躍。TMEM16A的氨基末端有一長片段a，當有可替代啟動子時也可跳過，這就導致蛋白缺少開始的116個氨基酸。但是缺少片段a轉錄出的蛋白也沒有片段b，c，d。這種亞型叫做TMEM16A(0)，只有840個氨基酸，而完整的TMEM16A(abcd)有1 008個氨基酸［2］。

膜片鉗實驗顯示TMEM16A的不同選擇剪切有不同的功能。片段b能減少TMEM16A通道對鈣離子的親和力。因此，TMEM16A(abc)和TMEM16A(ac)對鈣離子的敏感性相差近4倍［13］。另外，4個氨基酸(谷氨酸－丙氨酸－纈氨酸－賴氨酸)對應于片段c能改變電壓依賴性。有趣的是，片段c位于上述討論的可能的鈣結合位點4個谷氨酸殘基后面。表達異源的TMEM16A(0)會產生不同的氯電流，雖然是鈣依賴性的但是不受膜電位影響。此亞型的生理學特征還不清楚。

1.3 其他TMEM16蛋白 TMEM16A屬于TMEM16家族，此家族還包括其他9個成員，分別從 B到 K［5］。所有的TMEM16蛋白的拓撲結構相似，但同源性較低。TMEM16A的氨基酸序列有60%與16B相似。TMEM16B似乎也是構成CaCC的分子基礎。與TMEM16A相比，TMEM16B的電導低10倍，鈣離子敏感性更低，動力學活性更快［14］。這些不同可能指導識別通道門控和氯離子轉運的關鍵蛋白域。TMEM16A與其他家族成員的同源性較低，與F、G、H、K相似度只有20% ～30%。然而，TMEM16的跨膜結構部分的一級結構，顯示了高度的序列保守性。這些差異較多的TMEM16蛋白可能編碼不同的其他離子通道或轉運體。TMEM16F和16K在很多細胞和組織中高表達［15］。相反，TMEM16C和16G只特異性的分別表達在神經系統(tǒng)和前列腺。有趣的是，TMEM16E/ANO5(也叫做GDD1)是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個與人類遺傳疾病相關的TMEM16基因。TMEM16E蛋白的生理學功能還不清楚，但是已知它位于細胞內。有報道指出包括TMEM16A在內的許多TMEM16蛋白，產生的氯電流是由細胞腫脹引起的［16］。然而，與TMEM16有關的氯離子通道的生理物理學特性與容積敏感的氯離子通道(volume sensitive chloride channel，VSOAC)不同。因此，TMEM16和VSOAC可能代表著與細胞體積調節(jié)有關的不同類型的通道。

2 CaCCs的生理功能

2.1 上皮細胞分泌 CaCCs表達和發(fā)揮功能的重要位置之一就是上皮細胞。CaCCs為氯離子通過上皮細胞提供了路徑。分泌液通過轉運體進入呼吸道，細胞內積累的氯離子產生電化學梯度，通道開放，氯離子流入細胞外間隙而降低電化學梯度。Tarran等［17］用ATP或 UTP刺激氣管，發(fā)現(xiàn)其會激活上皮細胞上的P2Y2嘌呤能受體，從而誘發(fā)Ca2+依賴的Cl－的分泌。UTP激活Gq-P2Y嘌呤能受體可釋放IP3進而引起Ca2+的釋放。呼吸道上皮細胞共表達CaCCs和囊性纖維化跨膜通道調節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)，上皮粘膜層似乎由 CFTR和CaCCs共同調節(jié)［17］，粘膜層的基礎水平由 CFTR控制，CaCCs則為液層的敏感調節(jié)因子?？ò湍憠A、組胺和核苷酸能引起腸道內氯離子的短暫上調。這些激動劑增加了胞內鈣離子濃度，激活CaCCs進而觸發(fā)了分泌活動。然而，從囊性纖維性病人體內得到的腸上皮細胞對這些激動劑卻不敏感。所以雖然腸上皮細胞存在著CaCCs，但是他們的重要作用還需進一步研究確定。

2.2 神經興奮和心臟興奮性的調節(jié) 各種不同的神經元細胞都有CaCCs的表達，如背跟神經節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)神經元、脊髓神經元等。CaCCs在神經元細胞中的功能還不是十分確定，但它們在動作電位的復極化，膜振蕩行為中起關鍵作用。45%～90%的軀體感覺神經元，如感受皮膚溫度、觸覺、肌張力、疼痛的神經元，都有 CaCCs的表達［18］。軀體感覺神經元的胞體構成了背根神經節(jié)，DRG可傳導不同刺激如皮膚溫度、疼痛和觸感。DRG的一個亞群——中等直徑(30～40 μm)感覺神經元中顯示了 CaCCs的活性，這表明此通道與某些特殊的感覺傳導通路有關。最近的研究［10］表明小DRG神經元上的CaCC電流介導了緩激肽(bradykinin，BK)引發(fā)的急性傷害性疼痛。BK通過B2受體和磷脂酶C級聯(lián)反應使內鈣釋放進而激活CaCC。脊髓神經元中也有CaCCs的表達。在脊髓神經元中，Ecl約為±60 mV［6］。如果在動作電位期間CaCCs開放，可能會加速膜的復極化。這往往會限制動作電位的重復發(fā)生。

CaCCs在許多物種的心肌動作電位去極化過程中起了重要作用。在許多心肌細胞中，短暫的外向電流Ito2和Ito1對復極化的初相作用重大。Ito1是Ca2+敏感的K+電流，可被4-氨基吡啶抑制，Ito2是Ca2+激活的Cl－電流，卻對4-氨基吡啶不敏感［6］。CaCCs激活可產生Ito2，可導致膜去極化或復極化。在膜電位較正時，鈣-氯電流(ICl.Ca)為外向電流，氯離子內流，使膜電位變負。在膜電位較負時，氯離子外流，ICl.Ca能加速去極化和早后除極。Ca2+的狀態(tài)起了關鍵作用，決定了CaCCs對總的瞬時外向電流的相對貢獻。例如，β-腎上腺素刺激L-型通道或使心率加快可增加CaCCs的活性，也加大了鈣-氯電流對膜復極化的貢獻［6］。相反，膜電位的早復極化限制了鈣的內流，從而也限制了CaCCs的激活。

2.3 嗅覺轉導 蛙、大鼠、蠑螈的嗅覺感受器神經元都有CaCCs的表達［6］。CaCCs對嗅覺刺激的傳導起重要作用。氣味會結合并激活嗅覺感受器神經元纖毛膜上的G蛋白偶聯(lián)受體。這些受體激活腺苷酸環(huán)化酶，產生cAMP并打開環(huán)核苷酸門控的通道，使Na+和Ca2+內流。這樣就導致膜的去極化，使纖毛的［Ca2+］i升高，從而激活CaCCs。氯離子的外流(內向電流)使膜進一步去極化。藥物對氣味轉導機制中產生的ICl.Ca有重要作用。在蛙的嗅纖毛，大鼠、非洲爪蟾、蠑螈的嗅覺感受器神經元，尼氟滅酸(NFA)，氟芬那酸都可以抑制 ICl.Ca。

3 與腫瘤的關系

3.1 TMEM16A與腫瘤的關系 TMEM16A多年前就引起了腫瘤生物學家的興趣，那時還不知道它是離子通道，只知道他們在腫瘤細胞中高表達［5］。因為他們接近細胞表面而且在腫瘤細胞中高表達，因此他們被當做治療的潛在靶點和腫瘤的生物標記物。離子通道在腫瘤細胞中發(fā)揮著重要作用，這并不是一個新的觀點，但是此通道家族對腫瘤蛋白質組的研究卻提供了一個新的機制研究前景。胃腸間質細胞瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是在胃腸道中發(fā)現(xiàn)的最普遍的間質細胞瘤。TMEM16A在此腫瘤中高表達［19］，現(xiàn)已成為鑒定GIST的標志基因。雖然TMEM16A不是腫瘤發(fā)生的起因，但它可能支持腫瘤的發(fā)展。TMEM16A位于染色體11q13，而在很多腫瘤組織中該染色體區(qū)都是擴增的，這包括幾乎一半以上的鱗狀上皮細胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)，人頸鱗狀細胞癌。這就表明染色體11q13的擴增是由一組能促進腫瘤細胞增殖和遷移的基因驅動的。

雖然TMEM16A在腫瘤組織中高表達，但TMEM16A的突變與致癌作用并沒有聯(lián)系。更確切說，TMEM16A可能參與了細胞增殖或腫瘤發(fā)展。Kramer等發(fā)現(xiàn)當果蠅中TMEM16(Axs)點突變后會導致染色體不分離而影響減數(shù)分裂周期。Axs與TMEM16H、K有35%的相似。與他們一樣，Axs缺少折返環(huán)。這是否意味著Axs不是一個氯通道或者說這部分蛋白對氯通道的功能是可有可無的，仍需驗證。Axs在胚胎發(fā)育早期位于內質網，在減數(shù)分裂紡錘體期位于膜上。Axs點突變后Axs(D)會導致染色體不分裂，這表明在紡錘體形成和細胞周期進程中存在損傷。然而有趣的是，敲除Axs并不能重現(xiàn)Axs(D)的現(xiàn)象［20］?？赡苁且驗辄c突變Axs(D)會產生具有打亂減數(shù)分裂功能的新蛋白。而敲除后其他的TMEM16家族成員會替代Axs的功能。

3.2 其他TMEM16蛋白 其他的TMEM16蛋白與腫瘤也有關系。TMEM16G，也被叫做NGEP，特異性的表達在前列腺癌中［21］。TMEM16G剪切片段影響小鼠乳腺癌的遷移能力，而且與人類乳腺癌預后不良有關。因為TMEM16G在前列腺的特異表達，或許會成為潛在治療靶點。

4 TMEM16A功能特異性調節(jié)劑

在鑒定TMEM16A為CaCCs的分子基礎后，很多實驗小組著眼于研究TMEM16A的抑制劑，并取得了很大進展。Namkung等［22］發(fā)現(xiàn)紅酒和綠茶中存在的天然化合物鞣酸能明顯抑制TMEM16A電流而不影響CFTR和ENaC(Na+轉運體)，同時也不影響ATP和ionomycin誘發(fā)的胞內鈣離子濃度升高，其 IC50為6 μmol·L－1。鞣酸濃度較高時能完全抑制TMEM16A電流，但同時也能抑制TMEM16B介導的電流。而Namkung等［23］的藥物篩選研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑苯并吡唑類化合物能明顯抑制TMEM16A電流，抑制作用較強的A組化合物結構母核為硫代乙酰基連接的嘧啶環(huán)與苯并吡唑環(huán)，其中抑制作用最強的化合物T16Ainh-A01的IC50僅為1 μmol·L－1。這些抑制劑直接作用于TMEM16A，而不是作用于上游(如與激動劑結合或鈣離子信號)。雖然小分子抑制劑能明顯抑制TMEM16A電流，但也會同時抑制TMEM16B電流，所以篩選TMEM16A功能特異性的調節(jié)劑仍須努力。分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)對于研發(fā)治療高血壓、疼痛、腹瀉等疾病的藥物提供了支持。

5 結語

TMEM16A基因被報道為CaCCs的可能分子基礎后，其成為了眾多研究者的焦點，并取得了一些進展。如Manoury等［24］發(fā)現(xiàn)在人肺動脈平滑肌細胞上，TMEM16A介導了CaCCs電流。另有研究表明頜下腺腺泡細胞和肝膽管上皮細胞均有TMEM16A的表達。盡管由于發(fā)現(xiàn)TMEM16A為CaCCs的分子基礎后對CaCCs的研究有了很大進展，但仍存在有許多懸而未決的問題。如在CaCCs的鈣離子結合位點、CaCCs特異性抑制劑、TMEM16A基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其影響機制，以及TMEM16家族其他蛋白功能等方面仍存在很多待解決問題。而TMEM16A或許會成為治療多種人類疾病如囊性纖維性病、高血壓、胃腸蠕動障礙、哮喘和腫瘤的新型藥物靶點。

［1］ Miledi R.A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes［J］.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1982，215(1201):491－7.

［2］ Caputo A，E Caci L，F(xiàn)errera，et al.TMEM16A，a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity［J］.Science，2008，322(5901):590 －4.

［3］ Schroeder B C，Cheng T，Jan Y N，et al，Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit［J］.Cell，2008，134(6):1019 －29.

［4］ Yang Y D，Cho H，Koo J Y，et al.，TMEM16A confers receptoractivated calcium-dependent chloride conductance［J］.Nature，2008，455(7217):1210－5.

［5］ Galindo B E，Vacquier V D.Phylogeny of the TMEM16 protein family:some members are overexpressed in cancer［J］.Int J Mol Med，2005，16(5):919－24.

［6］ Hartzell C，Putzier I，Arreola J.Calcium-activated chloride channels［J］.Annu Rev Physiol，2005，67:719 －58.

［7］ Ferrera L A，Caputo，Galietta L J.TMEM16A protein:a new identity for Ca2+-dependent Cl－channels［J］.Physiology(Bethesda)，2010，25(6):357－63.

［8］ Duran C，Thompson C H，Xiao Q，et al.Chloride channels:often enigmatic，rarely predictable［J］.Annu Rev Physiol，2010，72:95－121.

［9］ 焦東軍，岳 朋，杜智敏，等.氯通道阻滯劑抑制人腎小球系膜細胞增殖［J］.中國藥理學通報，2007，23(1):86－90.

［9］ Jiao D J，Yue P，Du Z M，et al.Chloride channel blockers inhibit proliferation of human glomerular mesangial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(1):86 －90.

［10］ Liu B，Linley J E，Du X，et al.The acute nociceptive signals induced by bradykinin in rat sensory neurons are mediated by inhibition of M-type K+channels and activation of Ca2+-activated Clchannels［J］.J Clin Invest，2010，120(4):1240 －52.

［11］陳婭斐，李 婷，安海龍，等.跨膜蛋白16A:鈣激活氯通道的最新進展［J］.生物化學與生物物理學進展，2010，37(11):1175－81.

［11］ Chen Y F，Li T，An H L，et al.TMEM16A:Advances in Calcium activated Chloride channel［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37(11):1175－81.

［12］ Bao L，Kaldany C，Holmstrand E C，et al.Mapping the BKCa channel's“Ca2+bowl”:side-chains essential for Ca2+sensing［J］.J Gen Physiol，2004，123(5):475 －89.

［13］ Ferrera L，Caputo A，Ubby I，et al.Regulation of TMEM16A chloride channel properties by alternative splicing［J］.J Biol Chem，2009，284(48):33360－8.

［14］ Ousingsawat J，Martins J R， Schreiber R， et al. Loss of TMEM16A causes a defect in epithelial Ca2+-dependent chloride transport［J］.J Biol Chem，2009，284(42):28698 －703.

［15］ Rock J R，Harfe B D.Expression of TMEM16 paralogs during murine embryogenesis［J］.Dev Dyn，2008，237(9):2566 －74.

［16］ Almaca J，Tian Y，Aldehni F，et al.TMEM16 proteins produce volume-regulated chloride currents that are reduced in mice lacking TMEM16A［J］.J Biol Chem，2009，284(42):28571－8.

［17］ Tarran R，Loewen M E，Paradiso A M，et al.Regulation of murine airway surface liquid volume by CFTR and Ca2+-activated Cl－conductances［J］.J Gen Physiol，2002，120(3):407 － 18.

［18］ Currie K P，Wootton J F，Scott R H.Activation of Ca2+-dependent Cl－currents in cultured rat sensory neurones by flash photolysis of DM-nitrophen［J］.J Physiol，1995，482(Pt 2):291 －307.

［19］ Espinosa I，Lee C H，Kim M K，et al.A novel monoclonal antibody against DOG1 is a sensitive and specific marker for gastrointestinal stromal tumors［J］.Am J Surg Pathol，2008，32(2):210－8.

［20］ Hartzell H C，Yu K，Xiao Q，et al.Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl－channels［J］.J Physiol，2009，587(Pt 10):2127－39.

［21］ Das S，Hahn T，Nagata S，et al.NGEP，a prostate-specific plasma membrane protein that promotes the association of LNCaP cells［J］.Cancer Res，2007，67(4):1594 －601.

［22］ Namkung W，Thiagarajah J R，Phuan P W，et al.Inhibition of Ca2+-activated Cl－channels by gallotannins as a possible molecular basis for health benefits of red wine and green tea［J］.FASEB J，2010，24(11):4178－86.

［23］Namkung W，Phuan P W，Verkman A S.TMEM16A inhibitors reveal TMEM16A as a minor component of calcium-activated chloride channel conductance in airway and intestinal epithelial cells［J］.J Biol Chem，2010，286(3):2365－74.

［24］ Manoury B，Tamuleviciute A，Tammaro P.TMEM16A/anoctamin 1 protein mediates calcium-activated chloride currents in pulmonary arterial smooth muscle cells［J］.J Physiol，2010，588(Pt 13):2305－14.