當(dāng)歸A3活性部位對小鼠巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶-2活性及基因表達(dá)的影響

沈建芬，張又枝，肖軍花，王嘉陵

(1.浙江省嘉興市第一醫(yī)院，浙江嘉興 314000;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030)

當(dāng)歸為傘型科植物當(dāng)歸〔Angelica Sinensis(Oliv.)Diels〕的干燥根，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和補血調(diào)經(jīng)之功效。其主要活性成分為當(dāng)歸揮發(fā)油，實驗證明當(dāng)歸揮發(fā)油具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，且其抗炎作用與減少 PGs量有關(guān)［1］。

當(dāng)歸A3活性部位(以下簡稱A3)是從當(dāng)歸總揮發(fā)油(CO2超臨界法提取)中萃取得到的中性、非酚性部位［1］。我們前期的研究［3］發(fā)現(xiàn):A3對小鼠二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的炎癥模型均具有明顯的抗炎作用，并對脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)離體大鼠子宮組織環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)增高具有抑制作用。本文采用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為對象來制備炎癥模型，觀察A3對LPS誘導(dǎo)的PGE2生成、COX-2酶活性及基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步從細(xì)胞及基因水平探討其抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 當(dāng)歸油(angelicaoil，AO)含藁本內(nèi)酯＞70%，由山東綠葉制藥股份有限公司提供;當(dāng)歸A3部位，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系植化室提供，每100 mg A3用濃度10 g·L－1吐溫80(Tween-80)助溶。小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室葉篤筠教授慷慨惠贈。脂多糖(LPS)購自Sigma公司;NS-398購自Cayman公司;花生四烯酸(arachidonic acid，AA)及 ELISA試劑盒購自R＆D公司;RTzol總RNA提取試劑購自Gibco Brl公司;COX-2多克隆抗體購自武漢博士德公司，COX-2及β-actin引物設(shè)計合成均由北京奧科公司提供;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽購自Bio＆Rad，PCR儀(PCYL001)購自Hybaid。全自動數(shù)碼成像系統(tǒng)及分析系統(tǒng)(GeneGenius)購自美國SYNGENE公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RAW264.7用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，采用10代左右的細(xì)胞進(jìn)行實驗。LPS(－)為陰性對照組;LPS(+)組加 1 mg·L－1LPS;Tween-80組同時加1 mg·L－1LPS 和 10g·L－1Tween-80;A320、40、80 mg·L－1組分別同時加入 1 mg·L－1LPS 和 20、40、80 mg·L－1的 A3。測 PGE2產(chǎn)量和 COX-2酶活性時陽性對照組分別加入1 mg·L－1LPS和1、10、100 μmol·L－1NS-398。每個實驗組和對照組重復(fù)3次，取平均值。

1.3 ELISA法檢測PGE2產(chǎn)量和COX-2酶活性將培養(yǎng)細(xì)胞等量接種于96孔板中，加入吲哚美辛10 mg·L－1，2 h后用 PBS洗3次，然后分組，加入不同藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液按照酶聯(lián)免疫試劑盒測定PGE2產(chǎn)量。若加入 AA 10 μmol·L－1130 min后收集上清液，測定的 PGE2產(chǎn)量代表COX-2活性。

1.4 RT-PCR檢測RAW264.7 COX-2 mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞等密度接種于6孔培養(yǎng)板中，各組加入不同試劑，培養(yǎng)8 h后，采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，按照一步法RT-PCR試劑盒說明操作。COX-2引物序列正義:5'AAATGCTGGTGTGGAAGGTG3'，反義:5'GAAGTTCAGCCTGGCAAGTCT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物269 bp。內(nèi)參照 β-actin引物正義:5'TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3'， 反 義:5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3'，擴(kuò)增片斷長度349 bp。RT-PCR條件:42℃ 60 min逆轉(zhuǎn)錄，94℃ 5 min預(yù)變性，然后94℃ 1 min變性，55℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照后進(jìn)行密度掃描，以COX-2/β-actin灰度值計算待測基因的相對表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測 RAW264.7 Cox-2蛋白表達(dá) 細(xì)胞等密度接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，各組加入不同試劑，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法調(diào)整至相同濃度，以 50 μg·L－1上樣，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維膜用含5%脫脂奶粉封閉液封閉，此后分別加入COX-2兔抗一抗(1∶200稀釋)，4℃ 孵育過夜，TTBS漂洗，加入二抗(1∶1 000稀釋)孵育，再以PBST液振蕩洗滌15 min×3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠定量軟件Quantity One 4.52分析。

2 結(jié)果

2.1 A3對PGE2產(chǎn)量的抑制作用 LPS 1 mg·L－1

能誘導(dǎo)細(xì)胞增加PGE2產(chǎn)量(P＜0.05)，A3能夠劑量依賴性地減少PGE2產(chǎn)量(P＜0.05)。A380 mg·L－1明顯抑制PGE2產(chǎn)量，其抑制率達(dá)到48.59%，陽性對照藥 NS-398 100 μmol·L－1的抑制率為 71%，見Tab 1。

Tab 1 Inhibitory effects of A3on LPS-induced PGE2production in RAW 264.7 macrophage cells

2.2 A3對COX-2 mRNA表達(dá)的抑制作用 LPS組COX-2 mRNA表達(dá)量較陰性對照組明顯增高(P＜0.05)，10 g·L－1Tween-80 對COX-2 mRNA 表達(dá)無影響(P ＞0.05)。A3(20、40、80 mg·L－1)可劑量依賴地抑制LPS誘導(dǎo)COX-2 mRNA表達(dá)增加，見Fig 1。

2.3 A3對COX-2蛋白表達(dá)的抑制作用 10 g·L－1吐溫-80對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 COX-2蛋白表達(dá)增加無影響，給予 A320、40、80 mg·L－1處理細(xì)胞后，可劑量依賴性地減弱LPS誘導(dǎo)COX-2蛋白條帶灰度，見Fig 2。

Fig 1 Effects of A3on COX-2 mRNA expression in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells(±s，n=3)

Fig 2 Effects of A3on COX-2 protein expression in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells(±s，n=3)

2.4 A3對COX-2酶活性的抑制作用 COX-2酶催化外源性AA代謝，從而生成PGE2的量可以反映COX-2酶活性。A3能夠濃度依賴性地抑制COX-2酶活性(P ＜0.05或 P ＜0.05)。A380 mg·L－1和NS-398 100 μmol·L－1的抑制率分別為 54% 和67.81%，見 Tab 2。

Tab 2 Inhibitory effects of A3on Cox-2 enzyme activity in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells(±s，n=3)

Tab 2 Inhibitory effects of A3on Cox-2 enzyme activity in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells(±s，n=3)

#P＜0.05 vs LPS(－);LPS(－)1=Tween-80，LPS(－)2=DMSO;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS(+)

Group PGE2/μg·L －1Inhibitory rate/%LPS(－)158.25 ±8.17 LPS(+)1 mg·L －1 79.95 ±5.53#A3 20 mg·L －1 65.32 ±1.63* 18.30 40 mg·L －1 50.12 ±4.85* 37.31 80 mg·L －1 36.78 ±0.66＊＊ 54.00 LPS(－)2 60.18 ±3.33 NS-398 1 μmol·L －1 56.97 ±7.86* 28.73 10 μmol·L －1 46.66 ±2.58＊＊ 41.63 100 μmol·L －1 25.73 ±2.49＊＊67.81

3 討論

前列腺素(prostaglandins，PGs)是一種與炎癥緊密相關(guān)的重要介質(zhì)，環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是將花生四烯酸代謝成PGs過程中的第一限速酶。COX存在兩種異構(gòu)體，COX-1是結(jié)構(gòu)性表達(dá)基因，屬“看家基因”，調(diào)節(jié)正常生理功能，其中COX-2為誘導(dǎo)酶，又稱“炎性反應(yīng)基因”，通常不表達(dá)或低表達(dá)，在遇到外界刺激如脂多糖、致癌基因等時可在巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中高表達(dá)，從而引起AA代謝產(chǎn)物PGs等炎癥介質(zhì)大量釋放，導(dǎo)致紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)［4］。越來越多的證據(jù)表明，COX-2與炎癥性疾病的關(guān)系非常密切，在多種炎癥疾病和動物炎癥模型的炎性滲出液中均發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，抑制COX-2可有效減輕炎癥損傷［5］。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的炎性和免疫效應(yīng)細(xì)胞，在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。LPS是引起炎癥的一類重要誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞中COX-2高表達(dá)，并由此引起催化產(chǎn)物炎性PGE2的大量生成。同時，當(dāng)COX-2活性增加時，也能引起PGE2生成增加［6］。為了制造和炎癥類似的過程，文獻(xiàn)一般以巨噬細(xì)胞株RAW264.7為對象，用LPS誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)量和COX-2基因表達(dá)來制造炎癥模型［7］。本文也證實了這個結(jié)論，表明本文用LPS制造炎癥模型是成功的。

在對傳統(tǒng)中藥研究中發(fā)現(xiàn)，很多中藥具有良好抗炎作用［8］，且很多中藥可通過直接抑制COX-2的活性或抑制COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)等方面來干擾其功能，影響PGs的合成來發(fā)揮抗炎效應(yīng)［9－10］。

藥物抑制由COX-2催化底物外源 AA生成PGE2的作用主要與以下兩條途徑有關(guān):① COX-2的活性直接受抑制，導(dǎo)致COX-2催化能力的下降;②抑制COX-2 mRNA生成，下調(diào)COX-2的酶蛋白水平，減少COX-2量的生成，導(dǎo)致產(chǎn)物PGE2生成的下降。本實驗觀察到，A3能抑制PGE2產(chǎn)量、COX-2酶活性及COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)，表明A3抑制PGE2產(chǎn)量可能與抑制COX-2基因的表達(dá)有關(guān)。但A3抑制PGE2產(chǎn)量僅僅是因為抑制COX-2基因的表達(dá)，還是同時也能直接抑制COX-2酶活性，有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究為 A3具有抑制 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞PGE2的生成機(jī)制有了一定的認(rèn)識，這為A3開發(fā)成抗炎新藥提供了較好的理論依據(jù)。

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