歐洲越桔提取物改善小鼠葡萄膜炎的機制研究

姚 楠，李小迪，李善兵，何蓉蓉，栗原博

(1.廣東省中醫(yī)研究所，廣東廣州 510095;2.暨南大學中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

目前葡萄膜炎的發(fā)病機制尚未完全明確，缺乏理想的預(yù)防及治療措施［1］。葡萄膜炎動物模型的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素誘導的葡萄膜炎大鼠眼內(nèi)存在氧化應(yīng)激［2］。歐洲越桔屬于杜鵑花科越桔亞科植物，富含花色苷類化合物。本課題組首次發(fā)現(xiàn)歐洲越桔提取物(bilberry extract，BE，含有 42.04% 的花色苷)［3］對束縛應(yīng)激以及葡萄膜炎小鼠眼內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)都具有一定的改善作用［4－5］。在此，本研究對改善作用的機制進行了初步探討，研究了葡萄膜炎小鼠眼內(nèi)一氧化氮誘導型合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA的表達水平，核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)中的 NF-κB p65 mRNA以及蛋白的表達水平。

1 材料與方法

1.1 試劑 歐洲越桔提取物(bilberry extract，BE)(批號:28770/M1)購自意大利Indena S.p.A.公司，傷寒沙門菌脂多糖LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 動物 體質(zhì)量18～22 g，6周，♂，SPF級BALB/C小鼠90只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號:SCXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，照明時間為12 h·d－1(7:00～19:00)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.3 方法 將90只♂ BALB/C小鼠隨機分為正常(Control)對照組、模型(LPS)組、BE低劑量(LPS+BE 50 mg·kg－1)組、BE 中劑量(LPS+BE 100 mg·kg－1)組和 BE 高劑量(LPS+BE mg·kg－1)組共5組，每組18只小鼠。BE不同劑量給藥組連續(xù)5 d灌胃給予BE，Control組和LPS組給予同體積蒸餾水，每天1次。在第5天LPS組和BE各劑量組小鼠灌胃后立即進行LPS(來源于傷寒沙門菌)足底皮下注射，注射劑量為100 μg/只，24 h后乙醚麻醉處死小鼠收集眼球。通過半定量RT-PCR技術(shù)檢測眼組織iNOS和NF-κB p65基因表達，并且通過 Western blot技術(shù)檢測眼組織NF-κB p65蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 歐洲越桔提取物對注射LPS后小鼠眼組織iNOS mRNA和NF-κB p65 mRNA表達的影響 見 Tab 1。

Tab 1 Effects of bilberry extract(BE)on expression of iNOS and NF-κB p65 mRNA levels in eyes of micetreated with LPS(±s，n=18)

Tab 1 Effects of bilberry extract(BE)on expression of iNOS and NF-κB p65 mRNA levels in eyes of micetreated with LPS(±s，n=18)

##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs LPS group

Group Dose/mg·kg－1 iNOS NF-κB p65 Control 0.000 ±0.000 0.133 ±0.016 LPS 0.193 ±0.026## 0.207 ±0.011##LPS+BE 50 0.194 ±0.029 0.193 ±0.013 LPS+BE 100 0.194 ±0.020 0.148 ±0.018＊＊LPS+BE 200 0.169 ±0.019* 0.139 ±0.014＊＊

2.2 歐洲越桔提取物對注射LPS后小鼠眼組織NF-κB p65蛋白表達的影響 見Tab 2。

Tab 2 Effects of bilberry extract(BE)on expression of NF-κB p65 protein levels in eyes of mice treated with LPS(±s，n=18)

Tab 2 Effects of bilberry extract(BE)on expression of NF-κB p65 protein levels in eyes of mice treated with LPS(±s，n=18)

##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group

Group Dose/mg·kg－1 NF-κB p65 Control 0.380 ±0.048 LPS 0.908 ±0.071##LPS+BE 50 0.817 ±0.063 LPS+BE 100 0.771 ±0.038＊＊LPS+BE 200 0.674 ±0.046＊＊

3 討論

我們的研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NO水平在葡萄膜炎動物模型中明顯升高［5－6］。在本實驗中，與空白組相比，模型組iNOS mRNA表達的明顯增高，促使 iNOS酶活性提高，最終導致NO水平升高，而高劑量的 BE能明顯降低 iNOS mRNA的表達水平，從而降低 NO的水平。NF-κB p65是一種啟動iNOS等氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的核轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激可以誘導無活性的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB三聚體轉(zhuǎn)變成有活性的NF-κB二聚體進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［7］，而且NF-κB 與葡萄膜炎的發(fā)病密切相關(guān)［8］。我們針對 NF-κB p65的半定量RT-PCR檢測和Western blot檢測的結(jié)果很相似:在LPS組中，NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達都明顯升高，同時中劑量和高劑量的BE不僅明顯降低了其mRNA的表達水平，而且也降低了其蛋白表達水平，還表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

綜上所述，歐洲越桔提取物改善葡萄膜炎小鼠眼組織氧化應(yīng)激狀態(tài)可能與其降低NF-κB p65的表達有關(guān)，其具體的機制有待深入研究。

［1］ 姚 楠，何蓉蓉，栗原博.內(nèi)毒素誘導的葡萄膜炎動物模型研究進展［J］.眼科研究，2010，28(12):1187－90.

［1］ Yao N，He R R，Kurihara H.Progress of study on animal model of endotoxin-induced uveitis［J］.Chin Ophthalmic Res，2010，28(12):1187－90.

［2］ Bosch-Morell F，Roma J，Puertas F J，et al.Efficacy of the antioxidant ebselen in experimental uveitis［J］.Free Radic Biol Med，1999，27(3 －4):388 －91.

［3］ Bao L，Yao X S，Tsi D，et al.Protective effect of bilberry(Vaccinium myrtillus L.)extract on KBrO3-induced kidney damage in mice［J］.J Agric Food Chem，2008，56(2):420 －5.

［4］ 姚 楠，何蓉蓉，栗原博.歐洲越桔提取物對小鼠眼內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):694－5.

［4］ Yao N，He R R，Kurihara H.Effect of bilberry extract on oxidative stress status in eyes of mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):694－5.

［5］ Yao N，Lan F，He R R，et al.Protective effects of bilberry(Vaccinium myrtillus L.)extract against endotoxin－induced uveitis in mice［J］.J Agric Food Chem，2010，58(8):4731 －6.

［6］ 蘭 芳，何蓉蓉，姚 楠，等.葉黃素對小鼠葡萄膜炎氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1257－8.

［6］ Lan F，He R R，Yao N，et al.Improving effects of lutein on oxidative stress status in endotoxin-induced murine uveitis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1257 －8.

［7］ Sen C K，Packer L.Antioxidant and redox regulation of gene transcription［J］.FASEB J，1996，10(7):709 －20.

［8］ Srivastava S K，Ramana K V.Focus on molecules:nuclear factorkappaB［J］.Exp Eye Res，2009，88(1):2 －3.