哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSc)的技術(shù)研究進(jìn)展①

郝蕭 楊秀霞 樊廷俊

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266003)

誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)是通過在體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入幾個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄因子,實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞核的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。2006年Takahashi 和Yamanaka[1]從與干細(xì)胞多能性維持相關(guān)的24個(gè)候選因子中篩選出4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子組合Oct3/4、Sox2、c-Myc和KlF4,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和鼠尾成纖維細(xì)胞,成功誘導(dǎo)出小鼠iPS細(xì)胞。這一消息在生物學(xué)界引起了巨大轟動(dòng),國內(nèi)外科學(xué)家們開始對(duì)iPS技術(shù)產(chǎn)生極大的興趣。正是因?yàn)閕PS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞有相同的發(fā)育潛能,并且它的獲得不需要摧毀早期胚胎,從而避免引發(fā)倫理道德爭論,所以迄今研究iPS細(xì)胞的熱潮仍在持續(xù),并且未來有可能替代胚胎干細(xì)胞用于臨床研究[2]。

1 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

Oct4是胚胎發(fā)育多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,由Pou5f1基因編碼產(chǎn)生,它是全能性的標(biāo)志,能夠促使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成、維持ES細(xì)胞未分化前狀態(tài)并促進(jìn)其增殖。因此,Oct4在維持干細(xì)胞多能性和干細(xì)胞的分化命運(yùn)中起到重要作用[3]。

Sox2是Sox家族成員之一,也是胚胎發(fā)育早期多能性的一個(gè)標(biāo)志基因,在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、外胚層和生殖細(xì)胞中有表達(dá)。Sox2與Oct4一樣對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性狀態(tài)是不可或缺的[4]。

c-Myc是Myc癌基因家族的重要成員之一,具有增強(qiáng)細(xì)胞增殖的能力,并且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。由于c-Myc具有引起iPS細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn),在重編程過程中去除該基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的重編程進(jìn)程減慢,iPS細(xì)胞的形成效率顯著降低,并且推遲iPS細(xì)胞克隆的產(chǎn)生[5]。

KlF是屬于Kruppel樣因子的鋅指蛋白,具有癌基因?qū)傩浴Ｔ贓SC自我更新過程中KlF4起著積極的作用,又有實(shí)驗(yàn)表明,Klf4基因?qū)τ贓S細(xì)胞的自我更新和未分化狀態(tài)的維持并不是必需的,可以由其他的一些轉(zhuǎn)錄因子或小分子取代[6]。

此外,Nanog和Lin28也是重編程過程中用到的轉(zhuǎn)錄因子。綜上,實(shí)現(xiàn)重編程的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中,Oct4一直被認(rèn)為是重編程過程中不可缺少,在重編程起始過程中起到重要作用。而Sox2往往作為Oct4的協(xié)作因子對(duì)ESCs中的下游靶基因進(jìn)行調(diào)控,二者是維持胚胎干細(xì)胞特征所必須的轉(zhuǎn)錄因子。而Klf4和c-Myc作為癌基因,在重編程過程中其可能的作用是使成熟細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤樣轉(zhuǎn)變,賦予細(xì)胞無限增殖以及快速生長的能力,都可被同一蛋白家族的其它成員所替代,因此Klf4和c-Myc可能并非是重編程過程所必需的因子。

2 iPS技術(shù)的研究進(jìn)展

繼2006年Takahashi[1]首次建立了小鼠iPS細(xì)胞以來,iPS的研究雖然發(fā)展比較迅速,但是也存在許多問題和困難,如病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因可能會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組;誘導(dǎo)過程中使用致瘤基因致瘤;誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生效率低等。這些無疑將嚴(yán)重阻礙iPS細(xì)胞的實(shí)際應(yīng)用。因此,如何有效地提高病毒轉(zhuǎn)染的效率和安全性是我們亟待解決的問題。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的方法分為以下幾種。

2.1 整合方式

2.1.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 最初是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[7]表達(dá)4個(gè)重編程因子,然后將細(xì)胞在ES細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng),用多能性標(biāo)志分子Fbx15的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選,得到與ES細(xì)胞形態(tài)相似的克隆體(即iPS細(xì)胞)后,這些iPS細(xì)胞能夠表達(dá)ES細(xì)胞的特異性標(biāo)志基因,將得到的iPS細(xì)胞皮下注射免疫缺陷型小鼠可以使其發(fā)生含有3個(gè)胚層的畸胎瘤,將iPS細(xì)胞注射到小鼠囊胚中也可形成嵌合體,但是仍然沒有得到成活的嵌合體小鼠。這種傳統(tǒng)的方法存在誘導(dǎo)效率很低和細(xì)胞多能性不均一等不足;并且還存在內(nèi)在安全問題,不管是逆轉(zhuǎn)錄病毒,還是慢病毒,都會(huì)把外源基因整合到基因組DNA中,這就有可能引起宿主基因組的插入突變。由于轉(zhuǎn)錄因子中c-Myc和Klf4具癌基因?qū)傩?它們可以使誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞后代小鼠形成腫瘤。Nakagawa等[8]嘗試了去掉c-Myc因子,只用Oct4,Sox2和Klf43個(gè)因子來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞,雖然效率有所降低,但是得到的iPS后代小鼠在出生100d后沒有腫瘤形成。最近研究發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性重編程基因的表達(dá)量,來替代這4種重編程因子中的部分因子行使誘導(dǎo)功能以及提高誘導(dǎo)效率,如組蛋白脫乙?；敢种苿?丙戊酸(VPA),它可以誘導(dǎo)基因組水平的乙?；?促使細(xì)胞具有松弛的染色體結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)合異位表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或者下游次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子是有利的,通過小分子化合物提高重編程效率的同時(shí)還可以有助于減少參與重編程所需因子的數(shù)量,能夠同Oct4和Sox22種因子一同作用即可誘導(dǎo)原代人成纖維細(xì)胞重新編程為iPS細(xì)胞[9],大大降低了iPS細(xì)胞的致癌性,同時(shí)使誘導(dǎo)效率提高了100倍。

2.1.2 2A肽段序列和IRES技術(shù) 為了提高安全性,降低病毒的整合效率,Carey等[7]通過引入自剪切多肽2A序列和核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES序列,將轉(zhuǎn)錄因子用一個(gè)簡單的慢病毒載體實(shí)現(xiàn)同步表達(dá),減少了宿主細(xì)胞中的病毒載體的數(shù)量,從而降低了插入突變的概率。引入自剪切多肽2A序列是指在4種重編程因子之間分別插入3種不同的2A序列;同時(shí)引入2A序列和IRES序列是指在Oct4與Klf4通過F2A連接在一起的順反子和Sox2與c-Myc通過E2A連接的順反子之間插入IRES序列。2種方法相比,僅用自剪多肽2A序列連接的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在表達(dá)時(shí)容易引起下游順反子較低水平的表達(dá),而插入IRES序列的多順反子載體可以克服這種上游與下游順反子表達(dá)量的差異。

2.1.3 Cre/LoxP重組系統(tǒng) 還可以采用Cre/LoxP重組系統(tǒng)來切除整合的外源重編程因子,以獲得iPS細(xì)胞[10]。Cre重組酶是一種位點(diǎn)特異性重組酶,能介導(dǎo)2個(gè)LoxP序列之間的特異性重組,使LoxP位點(diǎn)之間的基因序列被刪除或重組。LoxP序列來源于P1噬菌體,是有2個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成,8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價(jià)結(jié)合,LoxP序列的13bp反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。如果2個(gè)LoxP序列位于一條DNA鏈上,且方向相同,Cre重組酶能有效切除2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列。但盡管如此,載體的一段DNA還留在插入位點(diǎn)上,因此仍然無法避免插入突變。

2.1.4 線性化的質(zhì)粒和piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子 為了降低插入突變,可以用線性化的質(zhì)粒和piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)表達(dá)4個(gè)重編程因子,強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)并建立iPS細(xì)胞系,然后在這些iPS細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)可以切除這4種外源重編程因子的轉(zhuǎn)座酶,誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS細(xì)胞就不再表達(dá)外源重編程因子,安全性有所提高。PB轉(zhuǎn)座子兩端各有一個(gè)連著可以瞬時(shí)表達(dá)插入或切除功能的轉(zhuǎn)座酶基因的反向重復(fù)序列,具體方法是將4種重編程因子插入到含有四環(huán)素或強(qiáng)力霉素啟動(dòng)子的PB-TET轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)染小鼠胚胎纖維母細(xì)胞,用反式四環(huán)素激活蛋白激活誘導(dǎo)iPS后,PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)翻譯表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶可將外源DNA徹底清除,并不引起基因組DNA序列的任何變化[11]。相對(duì)Cre介導(dǎo)的基因切除而言,PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種更安全的建立iPS細(xì)胞系的方法。

2.2 非整合方式

2.2.1 腺病毒載體 從誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的分子機(jī)制方面來看,通過導(dǎo)入外源轉(zhuǎn)錄因子基因,其表達(dá)產(chǎn)物可激活內(nèi)源的Oct4、Sox2等轉(zhuǎn)錄因子基因,從而開啟基因組的重編程過程,也就說明iPS細(xì)胞無需病毒載體整合進(jìn)宿主基因組,只需外源轉(zhuǎn)錄因子的瞬時(shí)表達(dá),激活內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子,此后iPS細(xì)胞多潛能性靠內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來維持,而不再需要外源基因的誘導(dǎo)與維持。由于iPS細(xì)胞的形成需大約10～12d的持續(xù)表達(dá)重編程因子,因此,對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間要求至少為10d。Stadtfeld等[12]為了避免造成基因組插入突變,采用腺病毒載體來介導(dǎo)重編程因子的轉(zhuǎn)染小鼠纖維母細(xì)胞和肝細(xì)胞來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞,并成功獲得了沒有外源基因整合的iPS細(xì)胞。

2.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo) Okita等[13]采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法來誘導(dǎo)鼠的胚胎纖維母細(xì)胞iPS細(xì)胞,由于質(zhì)粒載體在細(xì)胞培養(yǎng)過程中容易被稀釋和退化,所以設(shè)計(jì)了2種載體,一種是含Oct3/4、Sox2、Klf4的多順反子載體,另一種是含有c-Myc的單獨(dú)質(zhì)粒,反復(fù)交替轉(zhuǎn)染這2種載體,以保證重編程因子在重編程的前期持續(xù)表達(dá),但誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的效率很低。此外非整合型附著體載體腺病毒載體也被用于小鼠纖維原細(xì)胞和肝臟細(xì)胞iPS細(xì)胞的誘導(dǎo),該方法同樣存在效率低的問題。

2.2.3 重組蛋白 上述方法都是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了基因水平的操作,近年來有研究通過導(dǎo)入重編程因子的編碼蛋白的方法來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的形成。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞方法的建立標(biāo)志著iPS研究的又一重大的突破。轉(zhuǎn)導(dǎo)所用的重編程蛋白是原核表達(dá)表達(dá)的修飾了的重組蛋白,即將細(xì)胞穿膜肽序列連接到重編程因子的C末端上,由于細(xì)胞穿膜肽是一類攜帶大分子物質(zhì)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的小分子多肽,這樣的重組子表達(dá)的重組蛋白就可以直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核,從而啟動(dòng)細(xì)胞重編程過程,目前,重組蛋白誘導(dǎo)的小鼠和人iPS細(xì)胞都已成功建立[14～15]。重組蛋白誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的方法因?yàn)椴簧婕叭魏胃淖兗?xì)胞遺傳信息的風(fēng)險(xiǎn),所以是目前所有研究方法中最為安全和可行的。

2.2.4 mRNA 利用mRNA替代DNA,產(chǎn)生重新編碼細(xì)胞所需的4種蛋白質(zhì)。通過電穿孔或者陽離子載體將4個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的mRNA導(dǎo)入細(xì)胞,從而誘導(dǎo)細(xì)胞改變原有程序而轉(zhuǎn)變成iPS細(xì)胞,這種方法使細(xì)胞重新編程的速度和效率大大提高,只用以前的一半的時(shí)間大約只有17d,而效率是以前標(biāo)準(zhǔn)方法的100倍以上[16]。

此外,這種誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化而成的iPS細(xì)胞沒有發(fā)生癌變情況,而其功能卻基本等同與胚胎干細(xì)胞。它比傳統(tǒng)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞更像胚胎干細(xì)胞,因?yàn)樗鼈儧]有被改變基因。他們未來的目標(biāo)是能夠在未來使用干細(xì)胞充當(dāng)新健康細(xì)胞的來源以取代被疾病破壞的細(xì)胞。

3 iPS細(xì)胞的應(yīng)用研究

由于iPS細(xì)胞可由自體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生,因而應(yīng)用在疾病治療方面不存在免疫排斥現(xiàn)象,所以相比之下iPS細(xì)胞比ES細(xì)胞有更廣的應(yīng)用性。在再生醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、組織工程和藥物學(xué)等方面都有極大的應(yīng)用價(jià)值,必將成為生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。將來自患者的體細(xì)胞表達(dá)外源重編程因子以誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞,通過遺傳修飾改正有缺陷的基因,再分化得到功能正常的所需要的細(xì)胞,以進(jìn)行細(xì)胞移植治療,比如分化產(chǎn)生正常功能的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來治療肌萎縮側(cè)索硬化癥[17]。

iPS的研究持續(xù)高漲,并取得了許多令人矚目的成績,但仍有許多問題需要搞清楚,比如體細(xì)胞核重編程的具體機(jī)制,iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞究竟有無差異,如何實(shí)現(xiàn)iPS細(xì)胞的定向誘導(dǎo)等等,仍然需要進(jìn)一步的探索。但毋庸置疑的是iPS技術(shù)必定會(huì)給干細(xì)胞研究領(lǐng)域注入新的活力。

[1] Takahashi K.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663～676.

[2] Kehat I.Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and function properities of cardiomyocytes[J].ClinInvest,2001,108:407～414.

[3] Stadfeld M.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell rep rogramming in mouse[J].Cell Stem Cell,2008,2(3):230～240.

[4] 陳艷玫.轉(zhuǎn)錄因子Sox2的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2004,16(3):

129～134.

[5] Nakagawa M.Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts[J].Nat Biotechnol,2008,26:101～106.

[6] Shi Y.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds[J].Cell Stem Cell, 2008,3:568～574.

[7] Carey B W.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector[J].ProcNatl Acad Sci U S A,2009,106:157～162.

[8] Nakagawa M. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts[J].Nat Biotechnol,2008,26:101～106.

[9] Danwei Huangfu.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J].Nature,2008.

[10]Soldner F. Parkinson?ˉs disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J].Cell,2009,136:964～977.

[11]Woltjen K.piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,458:766～770.

[12]Stadtfeld M.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration[J].Science,2008,322:945～949.

[13]Okita K.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors[J].Science,2008,322:949～953.

[14]Zhou H.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4:381～384.

[15]Kim D.Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4:472～476.

[16]Luigi W. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA[J].Cell Stem Cell,2010:1～13.

[17]Dimos J T.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons[J].Science,2008,321:1218～1221.