HPLC測(cè)定宮炎康顆粒中阿魏酸的含量

劉倩 丁秋玲 包莉 張鳳龍

宮炎康顆粒處方由當(dāng)歸、川芎、赤芍、香附、紅花、延胡索等十二味中藥材組成，為中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第二十冊(cè)所收載，具有活血化瘀，解毒消腫的功效，用于慢性盆腔炎等癥。原標(biāo)準(zhǔn)中僅有芍藥苷的薄層鑒別[1]，由于當(dāng)歸、川芎為方中君藥，其有效成分均為阿魏酸，其作為一種指示性的化合物[2]，在藥材中含量相對(duì)較易測(cè)定。有關(guān)阿魏酸含量測(cè)定報(bào)道的方法有薄層掃描法[3]、高效毛細(xì)管電泳法[4]和高效液相色譜法[5-8]等，由于宮炎康顆粒處方成分復(fù)雜、含糖量高，測(cè)定時(shí)干擾較大，因此筆者采用了多次萃取分離并用高效液相色譜法測(cè)定該制劑中阿魏酸含量的方法，該法可有效排除干擾物質(zhì)，雜峰很少，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器、試藥和色譜條件

1.1 儀器與試藥 日本島津LC-10Ap高效液相色譜儀、SPD-10AP紫外檢測(cè)器。浙江大學(xué)N2000色譜工作站，AEU-200電子天平(日本島津);CBID960A超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀有限公司)，TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773-9910)，實(shí)驗(yàn)中中藥材均購(gòu)于常州安泰大藥房，經(jīng)鑒定均為藥典正品;宮炎康顆粒(自制，批號(hào):20101001，20101002，20101003);乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱:KromasilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-水(H3PO4調(diào) PH 至2.5)(20:80)，流速:0.8 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為313 nm;柱溫:25℃。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)，不應(yīng)低于3000。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品提取方法的選擇

2.1.1 供試品提取溶劑的選擇 取本品研細(xì)，取3份，每份3 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，分別加甲醇、甲酸-甲醇(5∶95)溶液、乙酸乙酯各40 ml，超聲提取30 min，放冷，再分別加甲醇、甲酸-甲醇溶液、乙酸乙酯至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液25 ml，蒸干，殘?jiān)?%碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調(diào)水層至PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，搖勻，分別作為供試品溶液。

精密吸取上述三種供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，照上述色譜條件測(cè)定阿魏酸的峰面積，并計(jì)算含量，三種溶劑提取的阿魏酸含量基本一致，但通過(guò)觀察峰中雜質(zhì)的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)以甲酸-甲醇為溶劑提取的供試品峰的雜質(zhì)峰數(shù)量最少，且分離效果最好，有利于色譜柱的保養(yǎng)維護(hù)，故選擇甲酸-甲醇(5∶95)為提取溶劑。

2.1.2 萃取次數(shù)的選擇 取本品研細(xì)，取3 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超聲提取30 min，放冷，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液 25 ml，蒸干，殘?jiān)?%的碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調(diào)水層至PH=2，再用乙醚提取4次，每次20 ml，1、2次提取液合并，第3次、第4次分別另置，分別揮干乙醚液，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，1、2次轉(zhuǎn)移并定容至5 ml棕色量瓶中，第3、4次分別轉(zhuǎn)移并定容至2 ml棕色量瓶中，搖勻，即得。

分別精密吸取上述3種溶液及對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，照上述色譜條件測(cè)定阿魏酸的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果表明:萃取3次，才能將阿魏酸萃取完全。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml溶液含阿魏酸10 μg)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品約3 g，研細(xì)，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超聲提取30 min，放冷，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液25 ml，蒸干，殘?jiān)?%的碳酸鈉溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，用鹽酸調(diào)水層至 PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，搖勻，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中測(cè)定。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 取缺當(dāng)歸、川芎的其余藥材，按照處方量和制備工藝制成陰性顆粒，并按上述供試品制備方法制成陰性對(duì)照液，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中測(cè)定，結(jié)果陰性無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液(濃度為 10.2 μg/ml)2，6，10，14，18 μl，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，阿魏酸進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=49531.9x+36973.2r=0.9997。表明阿魏酸在20.4～183.6ng之間，峰面積與其含量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定各峰面積，結(jié)果阿魏酸的平均峰面積為537791，RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的樣品(20101028)共5份，依照供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算含量，5份樣品中阿魏酸的含量平均為0.314 mg/袋，RSD為1.79%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取與重現(xiàn)性試驗(yàn)同一供試品溶液，在8 h內(nèi)每隔2小時(shí)分別進(jìn)樣10 μL，并測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.82%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品5份，各約1.5 g，精密稱定，于每份中加入5 ml的上述阿魏酸對(duì)照品溶液(10.2 mg/ml)，依法提取，進(jìn)樣10 μl，計(jì)算回收率，得平均回收率為98.65%，RSD為1.00%，說(shuō)明回收良好。

3 討論

3.1 色譜條件的確定 對(duì)于阿魏酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，《中國(guó)藥典》[5]一部中采用的為316 nm，本實(shí)驗(yàn)將阿魏酸用甲醇配制每1 ml含10.2 μg的溶液，以流動(dòng)相為空白，置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，從200～400 nm掃描，結(jié)果阿魏酸在313 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，流動(dòng)相在313 nm附近無(wú)吸收。故本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)選擇313 nm。流動(dòng)相的選擇參考文獻(xiàn)[6-8]，對(duì)不同比例的乙腈-0.085%磷酸溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%冰醋酸水溶液進(jìn)行了測(cè)試，用乙腈-0.085%磷酸溶液必須在35℃下測(cè)定時(shí)阿魏酸分離效果好，而改進(jìn)后用乙腈-水(用H3PO4調(diào)PH至2.5)在常溫下測(cè)定時(shí)阿魏酸分離效果就很好，所以選其作為本品的流動(dòng)相。

3.2 在對(duì)提取方法的選擇時(shí)，曾采用冷浸過(guò)夜、超聲30 min、回流1 h三種不同的提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果冷浸過(guò)夜提取不完全;回流提取雜質(zhì)干擾大;超聲30 min提取最為理想，其色譜峰符合要求。

3.3 采用流動(dòng)相作樣品的稀釋劑，可避免因流動(dòng)相與樣品稀釋劑的不同，使樣品中某些成分在流動(dòng)相中析出而導(dǎo)致堵塞管路的可能性。同時(shí)，阿魏酸不穩(wěn)定，見(jiàn)光易分解，應(yīng)放在棕色容量瓶中避光保存，且須當(dāng)天配制當(dāng)天測(cè)定。

[1]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).WS3-B-3921-98.

[2]胡益勇，徐曉玉.阿魏酸的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展.中成藥，2006，28(2):253-255.

[3]都述虎，金繼曙.腦復(fù)清膠囊中阿魏酸的含量測(cè)定研究.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2001，18(1):59-60.

[4]李喜鳳，邱天寶，胡亞楠，等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定蒲公英中阿魏酸的含量.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(16):27-29.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典:2010年版(一部)，2010:124.

[6]劉義梅.HPLC法測(cè)定復(fù)方銀杏口服液中阿魏酸的含量.中藥材，2005，28(2):147-148.

[7]董文桑，瞿發(fā)林.HPLC法測(cè)定鎮(zhèn)痛寧膠囊中阿魏酸含量.中國(guó)藥師，2009，12(3):359-360.

[8]方寶霞，李鵬，時(shí)曉亞，陳富超.高效液相色譜法測(cè)定生化膏中阿魏酸含量.藥物鑒定，2010，19(13):30-31.