血管內(nèi)皮生長因子及其受體與Cyclin E-CDK2在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化

王 東 李笑巖 李紅星 白咸勇

(濱州醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,山東煙臺(tái)264000)

肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤,它的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的過程[1]。目前研究表明[2]腫瘤都是血管依賴性的,其中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)與其受體(Vascular endothelial growth factor receptors,VEGFR)對(duì)于腫瘤的血管生成尤為重要。VEGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖,促進(jìn)肝細(xì)胞增長。而細(xì)胞周期的調(diào)控主要依賴于由各種細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)和相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)組成的蛋白激酶復(fù)合物來完成,其中Cyclin E-CDK2在細(xì)胞周期 G1/S期的轉(zhuǎn)折中起著重要作用[3]。目前對(duì)VEGF和Cyclin E在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系的研究比較少,所以我們利用二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)建立誘發(fā)性肝癌模型[4],模擬人體肝癌發(fā)生、發(fā)展過程,通過免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等實(shí)驗(yàn)方法觀察VEGF及其受體和Cyclin E及其受體的變化,探討VEGF和Cyclin E在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。

材料和方法

1.材 料

1.1 主要試劑

DEN購自 Sigma公司、兔來源 VEGFR1、Cyclin E、CDK2抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、非生物素二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

德國萊卡公司的ASP300組織脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)和BM2155組織切片機(jī);天津市桐林醫(yī)療電子儀器廠的 TP-A展片機(jī);日本奧林巴斯公司的生物顯微鏡;美國Media Cybernetics的IMA GEPROPLUS圖像分析系統(tǒng);日本Olympus公司的BX31數(shù)碼顯微照相系統(tǒng);美國BIO-TEIC儀器公司的EL-301型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

2.方 法

2.1 大鼠肝癌模型的建立及標(biāo)本收集

雄性 Wistar大鼠(SCXK(魯)20030008),體重150—200g,共84只,由山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,飼料由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為模型組(72只)和對(duì)照組(12只),模型組飼以含DEN的飲水,連續(xù)12周;對(duì)照組15只常規(guī)自由飲水。于實(shí)驗(yàn)第 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24周處死動(dòng)物,隨機(jī)抽取各時(shí)間點(diǎn)的模型組6只和對(duì)照組動(dòng)物1只,麻醉動(dòng)物,開腹觀察肝臟及其他各臟器的大體形態(tài)改變及轉(zhuǎn)移情況;迅速剖開胸腔,經(jīng)心臟穿刺取血5ml,靜止0.5h,離心,取血清,置于-80℃保存;取肝臟及肝癌組織置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,厚4μm,用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

2.2 采用ELISA檢測(cè)血清中VEGF的量

抗大鼠VEGF單克隆抗體包被于酶標(biāo)板上,除空白孔外,分別將各組大鼠的血清標(biāo)本(200μl/孔)及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100μl/孔)加入相應(yīng)孔中,用37℃孵箱孵育90min,甩去酶標(biāo)板內(nèi)的液體;加入生物素化的抗大鼠VEGF抗體工作液(100μl/孔),37℃孵箱孵育60min,洗板4次;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白與生物素結(jié)合物工作液(100μl/孔),37℃孵箱孵育 30min,洗板 5次;加入顯色劑90μl/孔,避光37℃孵箱孵育20min;加入終止液100μl/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值。

2.3 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè) VEGFR1、Cyclin E、CDK2蛋白表達(dá)

石蠟切片脫蠟至水,微波熱修復(fù),3%H2O210 min阻斷內(nèi)源性過氧化物,山羊血清封閉10min,分別滴加 1:100的兔抗大鼠 VEGFR1、Cyclin E、CDK2抗體4℃孵育18h,抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的多聚體,37℃孵育30min,DAB顯色10min,PBS終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。以 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

每只大鼠取2塊肝組織進(jìn)行連續(xù)切片,每隔10張切片取1張,連續(xù)取5張組織切片進(jìn)行染色,光鏡下觀察、攝片,同時(shí)每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,利用IMAGE-PROPLUS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,測(cè)定平均光密度值,每只大鼠計(jì)算出一個(gè)平均光密度值的平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用LSD法對(duì)對(duì)照組、肝細(xì)胞損傷期、肝細(xì)胞增生-硬化期、肝細(xì)胞癌變期分別進(jìn)行各組間兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)血清中的VEGF和VEGFR1、Cyclin E、CDK2在肝組織中表達(dá)的平均光密度值進(jìn)行相關(guān)分析。

結(jié) 果

1.大 鼠肝臟的病理學(xué)改變

對(duì)照組大鼠的肝臟表面光滑,色澤鮮艷呈褐色,質(zhì)地較軟。在光鏡下觀察肝細(xì)胞未見異常(圖1)。實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟在肝細(xì)胞損傷期(第1周至第8周)時(shí),肝細(xì)胞水腫、氣球樣變性逐漸加重,部分肝細(xì)胞核固縮甚至消失。肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見散在壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。肝細(xì)胞增生-硬化期(第9周至第16周)時(shí),出現(xiàn)大量形態(tài)不一、細(xì)胞排列不整齊、肝實(shí)質(zhì)內(nèi)纖維組織增生的假小葉;肝細(xì)胞水腫進(jìn)一步加重,可見不同程度的小泡性脂肪變性。出現(xiàn)嗜酸性和透明細(xì)胞增生灶,可見肝細(xì)胞增生結(jié)節(jié)。門管區(qū)靜脈擴(kuò)張充血,有不同程度的結(jié)締組織增生,向肝小葉內(nèi)延伸,伴隨膽小管增生(圖3)。肝細(xì)胞癌變期(第17周至第25周)時(shí),肝組織中可見大小不等的癌結(jié)節(jié)(圖4);肝癌細(xì)胞排列呈索狀和團(tuán)塊狀,可見不同程度的脂肪變性,部分區(qū)域有出血、壞死。癌周組織中可見細(xì)胞水腫、嗜酸變性、脂肪變性,并有肝細(xì)胞增生灶、增生結(jié)節(jié)及非典型增生結(jié)節(jié)。

2.血 清VEGF含量

各組大鼠血清中VEGF含量存在差異(F=19.0672,P<0.01),VEGF在對(duì)照組血清中含量最低,在肝細(xì)胞損傷期、肝細(xì)胞增生硬化期、癌變期大鼠血清中逐漸升高,以癌變期的最高(表1)。

表1 利用DEN誘發(fā)肝癌過程中大鼠血清中VEGF含量變化Table 1 The change of VEGF in rats serum in the process of liver cancer induced by DEN

3.V EGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白的表達(dá)

VEGFR1在正常肝組織中的陽性表達(dá)細(xì)胞較少(圖5);在肝細(xì)胞損傷期的大鼠肝臟中的陽性表達(dá)主要分布在變性或壞死灶周圍的肝細(xì)胞(圖6);在肝細(xì)胞增生-硬化期,陽性表達(dá)的肝細(xì)胞主要分布在增生間質(zhì)附近,尤其是血管周圍(圖7);肝細(xì)胞癌變期的肝癌細(xì)胞表達(dá)陽性,在癌周組織中也可見陽性表達(dá)的細(xì)胞(圖8)。

Cyclin E在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示為棕黃色,在對(duì)照組大鼠肝組織中陽性表達(dá)的細(xì)胞少(圖9);在肝細(xì)胞損傷期,陽性表達(dá)的細(xì)胞在變性壞死組織周圍分布較多,并有沿著殘余間質(zhì)分布的趨勢(shì)(圖10);在肝細(xì)胞增生-硬化期,陽性表達(dá)的細(xì)胞呈現(xiàn)出灶狀分布的特點(diǎn),按形成假小葉的特點(diǎn)分布(圖11);在肝細(xì)胞癌變期,肝癌細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞上均可見陽性表達(dá)(圖12)。

CDK2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá),在對(duì)照組中,陽性表達(dá)的細(xì)胞較少見(圖13);在肝細(xì)胞損傷期時(shí),可見少量陽性表達(dá)的細(xì)胞,也主要分布于變性壞死灶周圍(圖14);在肝細(xì)胞增生硬化期時(shí),陽性表達(dá)的細(xì)胞較損傷期時(shí)多,陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于膽管上皮、門管區(qū)、肝小葉周邊(圖15);在肝細(xì)胞癌變期時(shí),陽性表達(dá)細(xì)胞主要位于癌結(jié)節(jié)、增生結(jié)節(jié)內(nèi)(圖 16)。

VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)的平均光密度值均隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展有增高的趨勢(shì)(F值分別為78.8227、19.8682和77.022,P值均小于0.01)(表2)。大鼠血清中的VEGF與肝臟組織中VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)的平均光密度值隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)(r=0.834,F=42.1274,P<0.05)。

表2 大鼠肝組織VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)的平均光密度值(ˉx±s)Table 2 The mean optic density values of VEGFR1,Cyclin E and CDK2 protein expression in the rat liver tissue(ˉx ±s)

討 論

研究用含DEN的水飼養(yǎng)大鼠以誘發(fā)大鼠肝癌模型。肝細(xì)胞損傷期肝細(xì)胞水腫,部分肝細(xì)胞呈嗜酸性變;肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整,小葉內(nèi)可見灶性壞死,伴炎細(xì)胞浸潤,同時(shí)可見纖維組織增生及肝細(xì)胞再生。肝細(xì)胞增生-硬化期肝細(xì)胞水腫進(jìn)一步加重,表現(xiàn)出不同程度的脂肪變性;可見嗜酸性或透明細(xì)胞增生灶、肝細(xì)胞增生結(jié)節(jié)和非典型增生結(jié)節(jié);同時(shí)肝臟出現(xiàn)不同程度的肝硬化表現(xiàn)。癌變期,12只大鼠表現(xiàn)為肝細(xì)胞癌,肝癌細(xì)胞呈灶狀分布,有2例混合性肝癌;癌周組織細(xì)胞水腫、嗜酸性變、脂肪變性,并有肝細(xì)胞增生灶、增生結(jié)節(jié)及非典型增生結(jié)節(jié)。誘癌過程大鼠肝臟發(fā)生的病理學(xué)改變與人類肝癌的發(fā)病特點(diǎn)和過程接近,故本實(shí)驗(yàn)利用此肝癌模型,對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

VEGF與腫瘤的血管形成關(guān)系密切,并與抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)[5]。VEGF在正常組織中呈低水平、穩(wěn)定表達(dá),而在大多數(shù)惡性腫瘤中過表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到,在誘癌的過程中大鼠血清中的VEGF含量逐漸增高,在發(fā)生癌變時(shí)最高。有研究表明[6],VEGF在肝細(xì)胞癌(hepatic cell cancer,HCC)組織、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá),且癌組織中的表達(dá)比癌旁組織高約7倍,表明VEGF在肝癌發(fā)展過程中起重要作用[7]。肝癌細(xì)胞和肝細(xì)胞可以分泌VEGF,而VEGF的生物學(xué)功能是通過與其受體VEGFR結(jié)合后使受體自身磷酸化而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)觀察到肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞上均有VEGFR1的表達(dá),其表達(dá)量和大鼠血清中的VEGF含量呈正相關(guān)。提示在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中VEGF和VEGFR1表達(dá)均增加,進(jìn)而促進(jìn)血管的形成和肝細(xì)胞的異常增生。然而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖的原因之一,是過度細(xì)胞周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活,導(dǎo)致CDKs的過度作用。

Cyclin E是細(xì)胞周期蛋白中的一種,它可與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物,磷酸化其底物,釋放轉(zhuǎn)錄因子 E2F,啟動(dòng)DNA復(fù)制,使細(xì)胞由 G1期進(jìn)入S期,是 G1/S期轉(zhuǎn)換的主要限速因子[8]。Cyclin E在正常的組織細(xì)胞中為低表達(dá)或不表達(dá),但Cyclin E蛋白失去周期性表達(dá),若在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)水平高,則可持續(xù)地在整個(gè)細(xì)胞周期中激活CDK2,促使G1/S期轉(zhuǎn)換,使細(xì)胞發(fā)生異常增殖[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著肝癌發(fā)生發(fā)展Cyclin E和CDK2的表達(dá)逐漸增多,提示進(jìn)入S期的細(xì)胞增多,肝細(xì)胞表現(xiàn)出異常增殖的特點(diǎn),發(fā)生癌變。同時(shí)也觀察到Cyclin E及受體 CDK2與VEGFR1的表達(dá)量呈正相關(guān)。因此我們推測(cè),DEN誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展過程中,肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞分泌 VEGF增多,VEGF與VEGFR1結(jié)合,激活 VEGF信號(hào)通路,使 Cyclin E與CDK2結(jié)合,啟動(dòng)DNA的復(fù)制使細(xì)胞進(jìn)入S期,促使肝細(xì)胞異常增生,發(fā)生癌變。

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圖 版 說 明

圖1-4:HE染色;圖5-16:二步法免疫組織化學(xué)技術(shù),DAB顯色,蘇木精復(fù)染;標(biāo)尺=30μm

圖1 正常對(duì)照組大鼠肝臟(★示門管區(qū));

圖2 肝細(xì)胞損傷期大鼠肝臟(示嗜酸性變性的肝細(xì)胞);

圖3 肝細(xì)胞增生-硬化期大鼠肝臟(★示增生的膽小管);

圖4 癌變期大鼠肝臟(★示肝癌結(jié)節(jié))。

圖5 VEGFR1在對(duì)照組大鼠肝臟中的表達(dá);

圖6 VEGFR1在肝細(xì)胞損傷期大鼠肝臟的表達(dá);

圖7 VEGFR1在肝細(xì)胞增生硬化期大鼠肝臟的表達(dá)(＊示增生結(jié)節(jié));

圖8 VEGFR1在癌變期大鼠肝臟的表達(dá);

圖9 Cyclin E在對(duì)照組大鼠肝臟中的表達(dá);

圖10 Cyclin E在肝細(xì)胞損傷期大鼠肝臟的表達(dá);

圖11 Cyclin E在肝細(xì)胞增生硬化期大鼠肝臟的表達(dá)(＊示增生結(jié)節(jié));

圖12 Cyclin E在癌變期大鼠肝臟的表達(dá);圖13 CDK2在對(duì)照組大鼠肝臟中的表達(dá);

圖14 CDK2在肝細(xì)胞損傷期大鼠肝臟的表達(dá);

圖15 CDK2在肝細(xì)胞增生硬化期大鼠肝臟的表達(dá)(＊示增生結(jié)節(jié));

圖16 CDK2在癌變期大鼠肝臟的表達(dá)。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig Expression of VEGFR1,Cyclin E and CDK2 proteins in rat livertissue ofDEN-induced hepatocarcinogenesis model

Fig1-Fig4:HE staining;Fig5-Fig16: Immunohistochemical staining,DAB with haematoxyl in counterstain;Scale=30μm.

Fig.1 The rat liver of the control group(★portal area);

Fig.2 Hepatocyte injury period( Eosinophilic degeneration);

Fig.3 Hyperplasia sclerosis period(★hyperplasia of bile ductule);

Fig.4 Cancerous period(★cancerous node);

Fig.5 VEGFR1 expression in the control group;

Fig.6 VEGFR1 expression in the hepatocyte injury period;

Fig.7 VEGFR1 expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.8 VEGFR1 expression in the cancerous period;

Fig.9 Cyclin E expression in the control group;

Fig.10 Cyclin E expression in the hepatocyte injury period;

Fig.11 Cyclin E expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.12 Cyclin E expression in the cancerous period;

Fig.13 CDK2 expression in the control group;

Fig.14 CDK2 expression in the hepatocyte injury period;

Fig.15 CDK2 expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.16 CDK2 expression in the cancerous period.