人參皂苷對糖尿病大鼠腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶9及Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

蘇建明 倪海祥 黃 琦 朱 鋒

浙江省中醫(yī)院（浙江杭州310006）

糖尿病腎病（DN）特征性的病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腎小球、腎小管積聚導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化［1］，而ECM的堆積是由于ECM產(chǎn)生過多和降解減少所致?；|(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達(dá)和活性的改變，與ECM堆積關(guān)系密切?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）參與血管基底膜主要結(jié)構(gòu)成分-Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）的降解，與DN的關(guān)系密切［2-3］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對糖尿病時(shí)腎組織MMP-9和Col-Ⅳ表達(dá)改變進(jìn)行研究，并用人參皂苷進(jìn)行干預(yù)，以探討期防治DN的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 動物：健康雄性SPF級SD大鼠100只，12周齡，體質(zhì)量（300±20）g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF動物房飼養(yǎng)。試藥：人參皂苷，由浙江省中醫(yī)院制劑科提供；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；一抗，鼠抗人（MMP-9 和 Col-Ⅳ）抗體；二抗，羊抗鼠抗體；MMP-2、Col-Ⅳ，均購自北京中山生物制品有限公司。

1.2 模型制備 隨機(jī)留取正常對照組18只，其余隨機(jī)36只大鼠禁食過夜后，按70mg/kg，左下腹腔內(nèi)一次性注射1%STZ溶液 （pH 4.5的0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液在冰浴中新鮮配制）。注射后72h，用血糖儀測定尾尖血血糖，血糖≥16.7mmol/L的大鼠判定為糖尿病大鼠。

1.3 分組與給藥 將模型大鼠隨機(jī)分為模型組（18只）和人參皂苷組（18只）。人參皂苷組灌胃人參皂苷0.5g/kg（溶于10%纖維素鈉溶液），模型組和正常對照組灌胃等量生理鹽水。每日2次。

1.4 標(biāo)本采集 每周用血糖儀測尾尖血血糖，稱體質(zhì)量，并計(jì)算水和食物的攝入量。至實(shí)驗(yàn)第2、4、8周時(shí)每組各取6只大鼠留取尿液，苯巴比妥麻醉后行股動脈放血處死，留取股動脈血并取右腎稱質(zhì)量。右腎與體質(zhì)量的比值作為腎臟肥大程度的指標(biāo)。尿液用于測定尿肌酐、尿白蛋白測定，并用尿白蛋白與尿肌酐比值作為臨床腎損害的指標(biāo)。股動脈血用于測定血糖、C肽、肌酐。

1.5 標(biāo)本處理與免疫組化染色 大鼠腎臟經(jīng)10%甲醛固定，梯度乙醇逐步脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚2μm）。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后作PAS染色、HE染色以及MMP-2、Col-Ⅳ免疫組化染色，E法。一抗均為鼠抗人（MMP-9和Col-Ⅳ）抗體，二抗為羊抗鼠抗體，MMP-9的工作滴度為1∶80，Col-Ⅳ工作滴度為1∶100。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)PAS（空白對照）和正常兔血清取代一抗（陰性對照）。光鏡觀察腎組織病變與MMP-9、Col-Ⅳ的分布，免疫組化染色以細(xì)胞漿膜或間質(zhì)有棕黃色顆?；蚓€狀沉積為陽性，否則為陰性。MMP-9、Col-Ⅳ定量均采HPIAS-21000型高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)在高倍鏡下計(jì)算其陽性面積百分比（%），每張切片選取10個視野，求平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane’sT2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 STZ注射72h后，大鼠的血糖均≥16.7mmol/L，并逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食，體質(zhì)量增長緩慢等糖尿病癥狀。與正常對照組相比，血糖、腎臟肥大指數(shù)均升高，體質(zhì)量、C肽顯著下降，尿白蛋白排泄量有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人參皂苷治療對體質(zhì)量、腎臟肥大、尿白蛋白排泄有改善作用，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1；但其對血糖、血脂作用明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論一致［4-6］。見表2。

2.2 病理組織變化 HE染色下腎臟結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈粉紅色。PAS染色下正常對照組未見明顯的腎小球系膜增生及基底膜增厚，模型組8周時(shí)可見腎小球系膜輕度增生、腎小管輕度顆粒樣變、基底膜輕度增厚，但未見腎小球結(jié)節(jié)樣增生和動脈玻璃樣變性等典型的糖尿病腎臟改變，人參皂苷組上述病變程度更輕。模型大鼠腎組織MMP-9的組織定位MMP-9抗原免疫組化染色示棕黃色或深棕黃色，主要表達(dá)在大鼠腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、包曼氏囊壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞，偶見浸潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)。

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

與正常對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。 下同。

組 別C肽正常對照組（n=6）2周4周體質(zhì)量（g）227．6±43．9 267．8±47．6肥大指數(shù)（g/kg）3．8±0．12 3．7±0．51（ng/L）2．26±0．55 2．50±0．56 8 周 294．5±66．8 3．2±0．182．60±0．73 0．97±0．09*尿白蛋白肌酐（μg/mg）1．95±0．50 2．02±0．77 2．76±0．67 2．18±0．59模型組（n=6）2 周 176．8±26．2* 6．2±1．24*4 周 180．1±39．8* 6．0±0．41* 1．14±0．30* 2．33±0．95 8 周 188．2±40．4* 6．8±0．72* 1．57±0．63* 3．77±1．36人參皂苷組（n=6）2 周 176．2±21．8* 5．1±0．64* 1．44±0．37* 2．14±0．85 4 周 175．3±12．1* 5．8±0．42* 1．69±0．56* 2．32±0．73 8周197．8±20．5*6．7±0．71*1．26±0．49*2．85±0．78

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標(biāo)比較 （mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標(biāo)比較 （mmol/L，±s）

人參皂苷組（n=6）4 周 19．06±3．82**△ 6．8±1．02* 1．69±0．56* 2．32±0．73*8周21．02±4．21**△7．7±1．08*△1．26±0．49*△2．85±0．78*△

2．3 各組大鼠腎組織MMP-9、Col-Ⅳ表達(dá)比較 見表3。糖尿病大鼠腎小球MMP-9在2、4、8周時(shí)較對照組明顯下降 （P＜0．05），人參皂苷組腎小球 MMP-9高于糖尿病組，在 4、8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0．05）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在4、8周時(shí)腎小球MMP-9較2周時(shí)低（P＜0．05），而人參皂苷組則在4、8周時(shí)腎小球MMP-9較2周時(shí)高（P＜0．05）。各時(shí)期模型組腎間質(zhì)MMP-9與正常對照組相比，有升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），人參皂苷組較模型組腎間質(zhì)MMP-9有下降，第8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0．05）。糖尿病大鼠腎小球Col-Ⅳ的表達(dá)在 2、4、8 周時(shí)均較正常組升高（P 均＜0．05），而腎間質(zhì) Col-Ⅳ的表達(dá)在8周時(shí)較正常組明顯升高（P＜0．05）。人參皂苷組腎小球Col-Ⅳ的表達(dá)則較模型組下降，在4、8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），腎間質(zhì) Col-Ⅳ的表達(dá)也較模型組下降，在 8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達(dá)比較 （%，±s）

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達(dá)比較 （%，±s）

組 別 腎小球 腎間質(zhì)MMP-9 Col-Ⅳ MMP-9 Col-Ⅳ正常對照組（n=6）2周4周0．73±0．07 0．46±0．03 1．45±0．30 1．53±0．32模型組（n=6）人參皂苷組（n=6）8 周 0．40±0．03 2 周 0．29±0．11*4 周 0．11±0．03*8 周 0．13±0．04*2 周 0．33±0．08*4 周 0．56±0．08*△1．85±0．28 3．08±0．69＊3．01±0．38*3．41±0．41*2．25±0．32*2．33±0．41*△8周0．71±0．09*△2．79±0．35*△1．24±0．07 0．19±0．04 1．13±0．09 0．19±0．05 1．79±0．28 0．25±0．11 1．98±0．29 0．17±0．01 1．67±0．37 0．22±0．06 2．33±0．23 0．59±0．06 1．28±0．17 0．18±0．03 1．47±0．08 0．22±0．02 1．37±0．13*△ 0．27±0．07△

3 討 論

本研究用STZ制成糖尿病大鼠模型，并用人參皂苷治療，用免疫組化方法檢測腎小球及腎間質(zhì)MMP-9和Col-Ⅳ表達(dá)的變化。發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)腎小球MMP-9的表達(dá)下降，Col-Ⅳ表達(dá)上升，且隨病程進(jìn)展愈加明顯。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型中MMP-9在腎小球中的表達(dá)是降低的，這與其他相關(guān)研究［7］結(jié)果一致。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎間質(zhì)MMP-9的表達(dá)增加，而與Col-Ⅳ表達(dá)成正比?？赡艿氖窃谀I小球中，高血糖所致的諸多因素導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)下降在先，從而引起Col-Ⅳ的降解減少，Col-Ⅳ的積累增加，導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生。

人參為臨床上治療糖尿病的常用中藥，具有大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，生津止渴，安神益智之功效。既合“消渴”的基本病機(jī)“陰虛為本”，亦治久病及腎之下焦虛寒、陰陽兩虛。本研究觀察了人參皂苷對2型糖尿病實(shí)驗(yàn)大鼠相關(guān)指標(biāo)2周、4周、8周的影響，提示人參皂苷對腎臟的保護(hù)作用也可能通過減少ECM的形成起到保護(hù)腎細(xì)胞的作用。

由于各方面條件的限制，本研究例數(shù)尚少，此外，MMPs的表達(dá)調(diào)節(jié)大致可以分為基因水平的調(diào)節(jié)，酶原活化調(diào)節(jié)，活化后調(diào)節(jié)等調(diào)節(jié)方式［7-10］。相關(guān)藥物能否作用于在這幾個環(huán)節(jié)從而調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)尚待進(jìn)一步研究。由于人參皂苷成分較多，其療效是多耙向的，故其治療2型糖尿病的機(jī)制相對較復(fù)雜，確切機(jī)制尚不明確，有待于在進(jìn)一步的研究中篩選提取方式，闡釋其作用機(jī)理，尋找答案。

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