周曉玲 謝 勝 侯秋科
廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院(廣西柳州545001)
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種肝組織學改變,與酒精性肝?。ˋLD)相類似,但無過量飲酒史的臨床病理綜合征。近年來,發(fā)現(xiàn)通過中醫(yī)外治穴位埋線的方法對治療NAFLD效果明顯。本實驗通過觀察穴位埋線對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD及其膽固醇調(diào)控元件結合蛋白-1(SREBP-1)的影響,以探討穴位埋線對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD作用及其可能機制,為臨床應用提供參考。
1.1 實驗動物 雄性wistar大鼠40只,清潔級,體質(zhì)量170~200g,由廣西中醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗室室溫 (20±3)℃,分籠喂養(yǎng)。
1.2 試藥及儀器 肝組織總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)試劑盒為北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品。一抗兔抗大鼠SREBP-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。二抗羊抗兔IgG-HRP由武漢博士德公司提供。膽固醇及0.3%膽酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。豬油為市售。普通飼料和高脂飼料(含87.7%普通飼料+2%膽固醇+0.3%膽酸鈉+10%豬油)均購自廣西中醫(yī)學院實驗動物中心(桂檢證字2003A010號)。超敏發(fā)光液由北京普利萊公司提供。
1.3 分組及造模 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為4組:正常對照組、模型組、穴位埋線4周組、穴位埋線8周組,每組8只。模型組、穴位埋線4周組、穴位埋線8周組給予高脂飼料飲食,正常對照組給予普通飼料飲食,自由飲水。
1.4 穴位埋線治療方法 根據(jù)化痰利濕、活血化瘀的治則,穴位埋線治療組取豐隆、足三里、太沖、三陰交穴[1]。將大鼠置于自制固定器中,取雙側上述穴位,線穿進3號注射針頭內(nèi),將針頭刺入穴位,直刺約5mm,提插得氣后,用針芯抵住羊腸線(針芯由直徑0.1mm、長5mm毫針剪成平頭改成),緩緩退出針管,將羊腸線留在穴內(nèi)。每3日1次,穴位埋線4周組治療4周,穴位埋線8周組治療8周。模型組大鼠亦置入固定器中15min,但不進行治療。
1.5 標本采集 每組大鼠在治療結束后隔夜禁食12h,稱體質(zhì)量,以10%水合氯醛1mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,開腹后肉眼觀察肝臟情況,腹主動脈取血,0.5h內(nèi)離心取血清待檢。取肝左葉同一部位1cm×1cm×1cm組織置于細胞裂解液中,勻漿并收集蛋白,-20℃保存。
1.6 檢測方法 一般情況:觀察大鼠食欲行為、狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)及死亡情況,實驗結束測體質(zhì)量及肝濕質(zhì)量。血清指標測定:測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、TG、TC,全部采用全自動生化儀檢測。Western Blot檢測肝組織蛋白SREBP-1的表達:肝左葉同一部位每100mg組織加入400μL MPER蛋白提取試劑,在冰上充分勻漿后,收集勻漿液,10000r/min離心5min,轉移上清。分裝后,取50μL,加入6×蛋白質(zhì)樣品緩沖液10μL混勻,在100℃水浴中煮沸5min,各組取10μL在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后,電轉至PVDF膜,TTBS洗5min,3次,5%脫脂牛奶封閉30min,分別加兔抗ALP和VDR多克隆抗體(1∶1000)。4℃過夜,TTBS洗 5min,4次,分別與 HRP 標記的二抗羊抗兔IgG (1∶10000)室溫下振蕩孵育 1h,TTBS洗10min,4次,加超敏發(fā)光液反應5min,在暗室中曝光,后在顯影液和定影液中沖洗膠片,顯像后觀察結果。
1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(x±s)表示,計數(shù)資料比較采用檢驗,組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 各組一般情況比較 見表1。實驗過程中,穴位埋線4周組大鼠于第6周因肺部感染死亡1只。穴位埋線4周組其余大鼠和其余組大鼠生長發(fā)育良好,無死亡。與正常對照相比較,模型組大鼠肝臟濕質(zhì)量和肝指數(shù)(每100g體質(zhì)量的肝臟濕質(zhì)量)均顯著高于正常對照組(P<0.05)。與模型組相比,穴位埋線 4周組、穴位埋線8周組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量均較模型組有所下降,其中穴位埋線8周組肝指數(shù)與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.2 各組血清學指標比較 見表2。模型組大鼠血清ALT、AST較正常對照組大鼠顯著升高(P<0.01);與模型組相比,穴位埋線4周組、穴位埋線8周組大鼠ALT、AST均有下降趨勢,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。與正常對照組相比,模型組大鼠血清TC顯著升高(均為P<0.01),與模型組相比,穴位埋線4周組、穴位埋線8周組血清TG、TC均有下降,其中TC顯著下降(P<0.01)。
表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 (±s)
表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 (±s)
與正常對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P <0.05,△△P <0.01。 下同。
組 別正常對照組模型組穴位埋線4周組穴位埋線8周組n 8878體質(zhì)量(g)473.54±10.66 480.63±11.26 430.45±12.23△424.08±18.03△肝臟濕質(zhì)量(g) 肝指數(shù)12.98±0.30 2.73±0.06 18.56±0.52* 3.66±0.05*13.89±1.03△ 3.27±0.12 12.98±1.85△ 2.97±0.14△
表2 各組血清學指標比較 (±s)
表2 各組血清學指標比較 (±s)
組 別正常對照組模型組穴位埋線4周組穴位埋線8周組n 8878 ALT(U/L)70.31±4.62 123.21±8.56**83.12±10.21△69.21±8.21△AST(U/L)185.12±13.65 279.56±10.23**229.21±15.21△195.52±19.12△TG(mmol/L)0.81±0.08 0.51±0.05**0.28±0.06 0.21±0.08 TC(mmol/L)1.59±0.08 3.98±0.23**2.49±0.31△△2.21±0.27△△
2.3 肝臟SREBP-1的表達 模型組SREBP-1表達水平明顯高于正常對照組,穴位埋線4周組、穴位埋線8周組SREBP-1蛋白的表達水平均低于模型組,且穴位埋線8周組的蛋白表達低于穴位埋線4周組。見圖1。
圖1 肝臟SREBP-1蛋白電泳圖
SREBPs是一類能與膽固醇調(diào)節(jié)組件1(SRE-1)發(fā)生特異性結合的蛋白[2]。SREBP-1a主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合酶(如乙酰輔酶A羧化酶)以及TG代謝的低密度脂蛋白受體的基因轉錄,SREBP-1c則選擇性調(diào)控脂肪酸、TG以及糖代謝(如葡萄糖激酶)中基因的表達水平[3]。胰島素和類胰島素生長因子Ⅰ也可以通過SREBP-1介導LDL-R啟動子的激活,從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的膽固醇含量[4]。
NAFLD發(fā)病機制極為復雜,1998年Day和James提出的“二次打擊”學說已成為解釋該病發(fā)生機制的主要理論[5]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)在NAFLD的形成中發(fā)揮著“一次打擊”的作用,導致肝細胞脂肪變性。相關機制研究表明,胰島素受體底物2(IRS-2)是胰島素在肝中信號轉導的主要介導物,調(diào)控著胰島素敏感性,而核SREBPs能有效地取代和干擾反式作用因子的結合,來抑制下游P13K/Akt通路,從而減少糖原合成[6]。因此,SREBPs能直接下調(diào)IRS-2的轉錄,從而抑制胰島素信號轉導。推測這種分子機制解釋了糖原合成向脂質(zhì)合成的轉移以及IR的形成,而IR可通過增加糖酵解而促進肝細胞內(nèi)脂肪酸的合成,造成肝內(nèi)脂質(zhì)(主要為TG)蓄積而引起NAFLD。Shimomura等成功建立了SREBP-1c在肝臟過度表達的小鼠模型,觀察到這些小鼠出現(xiàn)了脂質(zhì)紊亂、IR和肝脂肪變性[7]。通過轉基因小鼠和基因剔除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c主要與脂肪酸代謝和糖代謝有關[8]。
已有研究表明,針刺在治療脂肪肝及肝纖維化方面有一定的效果[9]。穴位埋線的埋線過程與針刺過程相似,具有普通針刺療法的作用效果,并具備針刺“靜以留之”的長期作用,類似“埋針”療法。腸線在穴位內(nèi)慢慢軟化、分解、吸收的過程對穴位產(chǎn)生一種柔和而持久的刺激,從而達到慢性疾病長期治療的目的。我們通過大量的前期的臨床工作已發(fā)現(xiàn)穴位埋線對治療非酒精性脂肪肝的治療有效率達92.50%,可通過降低血清瘦素水平、改善胰島素抵抗,增加肝細胞對胰島素的敏感性,從而調(diào)節(jié)血脂代謝,達到治療NAFLD患者的作用[10]。本實驗顯示,與正常組相比,模型組SREBP-1的表達明顯高于正常組。本實驗Western blot結果顯示穴位埋線4周組、穴位埋線8周組的SREBP-1的蛋白表達水平明顯低于對照組。穴位埋線8周又低于4周治療組。初步證明穴位埋線對脂質(zhì)代謝具有時間的量效關系,同時也進一步證明了穴位埋線療法在調(diào)控胰島素抵抗信號通路方面具有重要意義。
綜上所述,中醫(yī)認為NAFLD的基本病機是脾腎虧虛,而在此體質(zhì)基礎上形成的痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物為本病發(fā)病之關鍵,因此我們在選擇穴位進行埋線治療時遵循化痰利濕、活血化瘀的治則。SREBP-1作為調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路中一個必不可少的元素參與脂質(zhì)的合成,通過穴位埋線治療能減弱SREBP-1的表達,這也許與NAFLD的脂質(zhì)的合成減少有關,調(diào)節(jié)SREBP-l表達可能是治療NAFLD的潛在的靶點。從而這在一定的程度上推斷穴位埋線療法對調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路各蛋白分子的表達有著潛在作用,也為今后進一步探討NAFLD中西醫(yī)病機的相關性提供可研究的方向。
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