穴位埋線對非酒精性脂肪性肝病大鼠SREBP-1表達的影響*

周曉玲 謝 勝 侯秋科

廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院（廣西柳州545001）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種肝組織學改變，與酒精性肝?。ˋLD）相類似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征。近年來，發(fā)現(xiàn)通過中醫(yī)外治穴位埋線的方法對治療NAFLD效果明顯。本實驗通過觀察穴位埋線對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD及其膽固醇調(diào)控元件結合蛋白-1（SREBP-1）的影響，以探討穴位埋線對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD作用及其可能機制，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 雄性wistar大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量170～200g，由廣西中醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗室室溫 （20±3）℃，分籠喂養(yǎng)。

1．2 試藥及儀器 肝組織總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）試劑盒為北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品。一抗兔抗大鼠SREBP-1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。二抗羊抗兔IgG-HRP由武漢博士德公司提供。膽固醇及0．3%膽酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。豬油為市售。普通飼料和高脂飼料（含87．7%普通飼料+2%膽固醇+0．3%膽酸鈉+10%豬油）均購自廣西中醫(yī)學院實驗動物中心（桂檢證字2003A010號）。超敏發(fā)光液由北京普利萊公司提供。

1．3 分組及造模 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組：正常對照組、模型組、穴位埋線4周組、穴位埋線8周組，每組8只。模型組、穴位埋線4周組、穴位埋線8周組給予高脂飼料飲食，正常對照組給予普通飼料飲食，自由飲水。

1．4 穴位埋線治療方法 根據(jù)化痰利濕、活血化瘀的治則，穴位埋線治療組取豐隆、足三里、太沖、三陰交穴［1］。將大鼠置于自制固定器中，取雙側上述穴位，線穿進3號注射針頭內(nèi)，將針頭刺入穴位，直刺約5mm，提插得氣后，用針芯抵住羊腸線（針芯由直徑0．1mm、長5mm毫針剪成平頭改成），緩緩退出針管，將羊腸線留在穴內(nèi)。每3日1次，穴位埋線4周組治療4周，穴位埋線8周組治療8周。模型組大鼠亦置入固定器中15min，但不進行治療。

1．5 標本采集 每組大鼠在治療結束后隔夜禁食12h，稱體質(zhì)量，以10%水合氯醛1mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，開腹后肉眼觀察肝臟情況，腹主動脈取血，0．5h內(nèi)離心取血清待檢。取肝左葉同一部位1cm×1cm×1cm組織置于細胞裂解液中，勻漿并收集蛋白，-20℃保存。

1．6 檢測方法 一般情況：觀察大鼠食欲行為、狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)及死亡情況，實驗結束測體質(zhì)量及肝濕質(zhì)量。血清指標測定：測定丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、TG、TC，全部采用全自動生化儀檢測。Western Blot檢測肝組織蛋白SREBP-1的表達：肝左葉同一部位每100mg組織加入400μL MPER蛋白提取試劑，在冰上充分勻漿后，收集勻漿液，10000r/min離心5min，轉移上清。分裝后，取50μL，加入6×蛋白質(zhì)樣品緩沖液10μL混勻，在100℃水浴中煮沸5min，各組取10μL在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉至PVDF膜，TTBS洗5min，3次，5%脫脂牛奶封閉30min，分別加兔抗ALP和VDR多克隆抗體（1∶1000）。4℃過夜，TTBS洗 5min，4次，分別與 HRP 標記的二抗羊抗兔IgG （1∶10000）室溫下振蕩孵育 1h，TTBS洗10min，4次，加超敏發(fā)光液反應5min，在暗室中曝光，后在顯影液和定影液中沖洗膠片，顯像后觀察結果。

1．7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，計數(shù)資料比較采用檢驗，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 各組一般情況比較 見表1。實驗過程中，穴位埋線4周組大鼠于第6周因肺部感染死亡1只。穴位埋線4周組其余大鼠和其余組大鼠生長發(fā)育良好，無死亡。與正常對照相比較，模型組大鼠肝臟濕質(zhì)量和肝指數(shù)（每100g體質(zhì)量的肝臟濕質(zhì)量）均顯著高于正常對照組（P＜0．05）。與模型組相比，穴位埋線 4周組、穴位埋線8周組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量均較模型組有所下降，其中穴位埋線8周組肝指數(shù)與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

2．2 各組血清學指標比較 見表2。模型組大鼠血清ALT、AST較正常對照組大鼠顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，穴位埋線4周組、穴位埋線8周組大鼠ALT、AST均有下降趨勢，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0．05）。與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC顯著升高（均為P＜0．01），與模型組相比，穴位埋線4周組、穴位埋線8周組血清TG、TC均有下降，其中TC顯著下降（P＜0．01）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 （±s）

與正常對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P ＜0．05，△△P ＜0．01。 下同。

組 別正常對照組模型組穴位埋線4周組穴位埋線8周組n 8878體質(zhì)量（g）473．54±10．66 480．63±11．26 430．45±12．23△424．08±18．03△肝臟濕質(zhì)量（g） 肝指數(shù)12．98±0．30 2．73±0．06 18．56±0．52* 3．66±0．05*13．89±1．03△ 3．27±0．12 12．98±1．85△ 2．97±0．14△

表2 各組血清學指標比較 （±s）

表2 各組血清學指標比較 （±s）

組 別正常對照組模型組穴位埋線4周組穴位埋線8周組n 8878 ALT（U/L）70．31±4．62 123．21±8．56**83．12±10．21△69．21±8．21△AST（U/L）185．12±13．65 279．56±10．23**229．21±15．21△195．52±19．12△TG（mmol/L）0．81±0．08 0．51±0．05**0．28±0．06 0．21±0．08 TC（mmol/L）1．59±0．08 3．98±0．23**2．49±0．31△△2．21±0．27△△

2．3 肝臟SREBP-1的表達 模型組SREBP-1表達水平明顯高于正常對照組，穴位埋線4周組、穴位埋線8周組SREBP-1蛋白的表達水平均低于模型組，且穴位埋線8周組的蛋白表達低于穴位埋線4周組。見圖1。

圖1 肝臟SREBP-1蛋白電泳圖

3 討 論

SREBPs是一類能與膽固醇調(diào)節(jié)組件1（SRE-1）發(fā)生特異性結合的蛋白［2］。SREBP-1a主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合酶（如乙酰輔酶A羧化酶）以及TG代謝的低密度脂蛋白受體的基因轉錄，SREBP-1c則選擇性調(diào)控脂肪酸、TG以及糖代謝（如葡萄糖激酶）中基因的表達水平［3］。胰島素和類胰島素生長因子Ⅰ也可以通過SREBP-1介導LDL-R啟動子的激活，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的膽固醇含量［4］。

NAFLD發(fā)病機制極為復雜，1998年Day和James提出的“二次打擊”學說已成為解釋該病發(fā)生機制的主要理論［5］。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）在NAFLD的形成中發(fā)揮著“一次打擊”的作用，導致肝細胞脂肪變性。相關機制研究表明，胰島素受體底物2（IRS-2）是胰島素在肝中信號轉導的主要介導物，調(diào)控著胰島素敏感性，而核SREBPs能有效地取代和干擾反式作用因子的結合，來抑制下游P13K/Akt通路，從而減少糖原合成［6］。因此，SREBPs能直接下調(diào)IRS-2的轉錄，從而抑制胰島素信號轉導。推測這種分子機制解釋了糖原合成向脂質(zhì)合成的轉移以及IR的形成，而IR可通過增加糖酵解而促進肝細胞內(nèi)脂肪酸的合成，造成肝內(nèi)脂質(zhì)（主要為TG）蓄積而引起NAFLD。Shimomura等成功建立了SREBP-1c在肝臟過度表達的小鼠模型，觀察到這些小鼠出現(xiàn)了脂質(zhì)紊亂、IR和肝脂肪變性［7］。通過轉基因小鼠和基因剔除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c主要與脂肪酸代謝和糖代謝有關［8］。

已有研究表明，針刺在治療脂肪肝及肝纖維化方面有一定的效果［9］。穴位埋線的埋線過程與針刺過程相似，具有普通針刺療法的作用效果，并具備針刺“靜以留之”的長期作用，類似“埋針”療法。腸線在穴位內(nèi)慢慢軟化、分解、吸收的過程對穴位產(chǎn)生一種柔和而持久的刺激，從而達到慢性疾病長期治療的目的。我們通過大量的前期的臨床工作已發(fā)現(xiàn)穴位埋線對治療非酒精性脂肪肝的治療有效率達92.50%，可通過降低血清瘦素水平、改善胰島素抵抗，增加肝細胞對胰島素的敏感性，從而調(diào)節(jié)血脂代謝，達到治療NAFLD患者的作用［10］。本實驗顯示，與正常組相比，模型組SREBP-1的表達明顯高于正常組。本實驗Western blot結果顯示穴位埋線4周組、穴位埋線8周組的SREBP-1的蛋白表達水平明顯低于對照組。穴位埋線8周又低于4周治療組。初步證明穴位埋線對脂質(zhì)代謝具有時間的量效關系，同時也進一步證明了穴位埋線療法在調(diào)控胰島素抵抗信號通路方面具有重要意義。

綜上所述，中醫(yī)認為NAFLD的基本病機是脾腎虧虛，而在此體質(zhì)基礎上形成的痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物為本病發(fā)病之關鍵，因此我們在選擇穴位進行埋線治療時遵循化痰利濕、活血化瘀的治則。SREBP-1作為調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路中一個必不可少的元素參與脂質(zhì)的合成，通過穴位埋線治療能減弱SREBP-1的表達，這也許與NAFLD的脂質(zhì)的合成減少有關，調(diào)節(jié)SREBP-l表達可能是治療NAFLD的潛在的靶點。從而這在一定的程度上推斷穴位埋線療法對調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路各蛋白分子的表達有著潛在作用，也為今后進一步探討NAFLD中西醫(yī)病機的相關性提供可研究的方向。

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