光剝奪導(dǎo)致大鼠抑郁樣改變及其機(jī)制研究

王為 趙廣宇 劉煜 李柱一 宿長軍

光剝奪導(dǎo)致大鼠抑郁樣改變及其機(jī)制研究

王為*趙廣宇*劉煜*李柱一*宿長軍*

目的 探討長時(shí)間光剝奪是否導(dǎo)致大鼠的抑郁樣改變，并從中樞甘丙肽水平和神經(jīng)元凋亡角度探討可能的病理機(jī)制。方法 隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠各12只，分別經(jīng)持續(xù)避光及正常光照條件下飼養(yǎng)6周后，以強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的靜止時(shí)間判定大鼠的抑郁表現(xiàn)，以免疫熒光染色法檢測大鼠腦部的甘丙肽水平及神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果 光剝奪組大鼠體重增加量及日均攝食量均低于光照組［(239.23±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的靜止不動(dòng)時(shí)間較光照組延長［(135.81±8.84)s vs(56.33±7.26)s，P＜0.05］，而中縫背核和藍(lán)斑處的甘丙肽水平(以積分光密度表示)降低［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13±2.68)，P＜0.01］，但并未觀察到神經(jīng)元凋亡。結(jié)論 長時(shí)間光剝奪可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn)，中樞甘丙肽水平的降低可能參與了這一過程。

抑郁 甘丙肽 光剝奪

目前對(duì)于抑郁癥的非藥物治療有光照療法等數(shù)種方式［1］，而在一種特定類型的抑郁癥－季節(jié)性情感障礙(Seasonal Affective Disorder，SAD)中，疾病的發(fā)生發(fā)展隨著不同季節(jié)中光照節(jié)律的變化而變化［2］。因此，光照改變導(dǎo)致的晝夜節(jié)律改變可能與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系，但二者的關(guān)系仍須進(jìn)一步明確且相關(guān)機(jī)制仍不清。有研究顯示，光剝奪后大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藍(lán)斑去甲腎上腺素神經(jīng)元等單胺能神經(jīng)元有凋亡現(xiàn)象［3］;而抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，其中近年的研究已顯示中樞甘丙肽(Galanin)水平的異?？赡芘c抑郁癥相關(guān)［4－6］，甘丙肽在中樞分布最豐富的區(qū)域正是藍(lán)斑等腦區(qū)［4］。為此本研究擬建立大鼠的光剝奪模型，并從藍(lán)斑等腦區(qū)中樞甘丙肽水平的變化和神經(jīng)元凋亡兩方面來探討大鼠抑郁的可能機(jī)制，為抑郁癥的病因機(jī)制探索積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及光剝奪模型的建立 體重150 g～180 g雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為光剝奪組和光照組各12只。前者始終置于暗室;后者置于正常光照房間，照明時(shí)間為8:00～18:00。各組每個(gè)鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)2只大鼠，鼠籠集中并列放置以盡量保持實(shí)驗(yàn)條件一致。每2～3天添加食水，每4～6天更換墊料，共飼養(yǎng)6周。各項(xiàng)日常操作，光剝奪組在弱紅光照明條件下迅速進(jìn)行。為消除行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中體重、體能等方面的差異可能對(duì)大鼠單純運(yùn)動(dòng)能力帶來的影響，另設(shè)置光照－2組大鼠6只。光照－2組飼養(yǎng)條件同光照組，但飼養(yǎng)時(shí)間縮短為4～5周，以保持與光剝奪組相同的體重。

1.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 模型建立后，光剝奪組及光照組各隨機(jī)選取6只大鼠，另選光照－2組6只大鼠，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)大鼠的抑郁狀態(tài)。選用直徑40 cm×高70 cm透明樹脂圓形水槽，水深40 cm，水溫28～30℃。實(shí)驗(yàn)首日每只大鼠適應(yīng)性游泳15 min。次日正式實(shí)驗(yàn)，每只大鼠游泳5 min，并全程錄像。參考既往相關(guān)研究［7］，將大鼠的活動(dòng)分為三類:靜止不動(dòng)行為，即大鼠漂浮無動(dòng)作或除了為避免沒入水中而劃水外再無其他行為;掙扎和攀爬行為，即大鼠持續(xù)用力沿水槽內(nèi)壁向上攀爬，試圖擺脫水環(huán)境;游泳和下潛行為，即大鼠在水槽內(nèi)四周游動(dòng)或主動(dòng)下潛。由未參與此研究的兩名實(shí)驗(yàn)員判讀實(shí)驗(yàn)錄像，記錄“靜止不動(dòng)行為”的總時(shí)間作為“靜止時(shí)間”。

1.3 大鼠中樞甘丙肽水平及神經(jīng)元凋亡的檢測 均采用免疫熒光染色法。模型建立后，光剝奪組及光照組各選取6只未參加強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的大鼠，進(jìn)行免疫熒光染色，觀察甘丙肽水平的變化及相關(guān)部位神經(jīng)元凋亡情況。大鼠經(jīng)常規(guī)灌注固定后取腦，冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚30μm。選取中縫背核、藍(lán)斑處切片，以0.3%Triton X－100處理30 min后分別入一抗:甘丙肽 H－80(Santa Cruz;1∶500)、抗－聚二磷酸腺苷核糖聚合酶p85片段(poly ADP－ribose polymerase p85，PARP p85)抗體(Promega;1∶500)，4 ℃孵育 24 h。二抗選用Alexa Fluor594驢抗兔IgG(Invitrogen;1∶500)，室溫孵育3 h。貼片封片后于熒光顯微鏡下觀察采圖。

觀察神經(jīng)元凋亡時(shí)，取體重250～300 g雄性SD大鼠6只，采取線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血－再灌注(middle cerebral artery occlusion/ischemic reperfusion，MCAO/IR)模型［8］作為陽性對(duì)照。模型建立24 h后，將大鼠常規(guī)灌注固定并取腦切片，切片部位廣泛選取，包括藍(lán)斑、中縫背核、皮層、下丘腦等。染色方法同前。

在針對(duì)甘丙肽的免疫熒光染色中，選取相同放大倍數(shù)、相同曝光時(shí)間的圖片，采用Image－Pro Plus軟件進(jìn)行分析。分別在各圖片的中縫背核、藍(lán)斑對(duì)應(yīng)處選取等大的測量區(qū)域，統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)的積分光密度(integral optical density，IOD)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0分析。結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。兩組間比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用 SNK(Student－Newman－Keuls)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、攝食量的比較 經(jīng)6周避光飼養(yǎng)后，光剝奪組大鼠體重增加量明顯小于光照組(t=5.71，P＜0.01)。同時(shí)，光剝奪組大鼠第5～6周期間的日均攝食量明顯低于光照組(t=11.09，P＜0.01)。見表1。

2.2 強(qiáng)迫游泳靜止不動(dòng)時(shí)間的比較 進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)的光剝奪組、光照組、光照－2組大鼠各6只，3組的體重有明顯差異(F=8.40，P＜0.01)。其中，光剝奪組與光照－2組體重均低于光照組(q=4.31，P＜0.05;q=5.30，P＜0.05)，但二者無明顯差異(q=1.79，P＞0.05)。3組強(qiáng)迫游泳的靜止時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.07，P＜0.01)，其中光剝奪組的靜止時(shí)間明顯長于光照組(q=25.23，P＜0.05)及光照－2組(q=23.96，P＜0.05)，而后兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.27，P＞0.05)。見表1。

2.3 中樞甘丙肽水平和神經(jīng)元凋亡情況的比較 與光照組比較，光剝奪組大鼠中縫背核、藍(lán)斑處甘丙肽熒光強(qiáng)度均明顯減弱(t=3.59，P＜0.05;t=14.82，P＜0.01)。見圖1和表1。在光剝奪組及光照組大鼠腦內(nèi)(包括中縫背核和藍(lán)斑)均無提示神經(jīng)元凋亡的PARP p85陽性細(xì)胞出現(xiàn)。而在作為陽性對(duì)照的MCAO/IR模型大鼠多個(gè)腦區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量PARP p85陽性細(xì)胞，在皮層處尤為明顯。見圖2。

表1 各組大鼠體重增加量、日均攝食量、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)靜止時(shí)間和中樞甘丙肽水平的比較

圖1 免疫熒光顯示大鼠中樞甘丙肽水平變化情況。圖A、C示光剝奪組大鼠中縫背核和藍(lán)斑甘丙肽表達(dá)情況;圖B、D示光照組大鼠中縫背核和藍(lán)斑甘丙肽表達(dá)情況。Aq:大腦水管;DR:中縫背核;4V:第四腦室;LC:藍(lán)斑

圖2 長期光剝奪大鼠中縫背核和藍(lán)斑內(nèi)未見凋亡神經(jīng)元出現(xiàn)。圖A～D示光剝奪組大鼠(A，C)和光照組大鼠(B，D)中縫背核(A，B)和藍(lán)斑內(nèi)(C，D)內(nèi)均未見凋亡神經(jīng)元。圖E示MCAO/IR模型組大鼠大腦皮層內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)元。Aq:大腦水管;DR:中縫背核;4V:第四腦室;LC:藍(lán)斑

3 討論

在美國的精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第4版中，SAD已不再被單獨(dú)列為一種情感障礙，而是重性抑郁障礙(Major Depressive Episode)的一種特殊類型。這一分類，反映了SAD與抑郁癥之間的密切聯(lián)系，也提示了利用光剝奪方法進(jìn)行研究，很可能對(duì)認(rèn)識(shí)更多類型抑郁癥的發(fā)病機(jī)理提供幫助。本研究通過模仿SAD發(fā)生發(fā)展中的重要因素－低光照，建立了大鼠的光剝奪模型，觀察了光剝奪后大鼠抑郁程度以及其中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)甘丙肽水平的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)過6周光剝奪，大鼠的攝食量和體重增加量均明顯低于對(duì)照組，且在校正體重差異帶來的影響后，其在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的靜止時(shí)間明顯延長。結(jié)合抑郁癥患者通常出現(xiàn)飲食減少、體重減輕的癥狀，并參考慢性非預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)［9］，可以認(rèn)為，光剝奪6周后的大鼠出現(xiàn)了抑郁樣表現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示，與正常光照組比較，光剝奪組大鼠還出現(xiàn)了中縫背核、藍(lán)斑處甘丙肽水平的降低。中縫背核、藍(lán)斑是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)甘丙肽表達(dá)最為豐富的區(qū)域［10］，這些位置甘丙肽水平的變化可反映整個(gè)中樞甘丙肽水平的變化。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的甘丙肽標(biāo)記物通常與膽堿能、兒茶酚胺能、5－羥色胺能的標(biāo)記物共存。尤其值得注意的是:在中縫背核處，大多數(shù)色氨酸羥化酶陽性的神經(jīng)元都會(huì)同時(shí)表達(dá)中等程度的甘丙肽［11］，前者是5－羥色胺合成的限速酶;與此類似，藍(lán)斑處的甘丙肽與多巴胺β－羥化酶的標(biāo)記物幾乎呈完全共存［11］，后者是去甲腎上腺素能神經(jīng)元的重要標(biāo)記物。抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與多種神經(jīng)遞質(zhì)的異常有關(guān)，其中就包括5－羥色胺以及去甲腎上腺素等單胺類遞質(zhì)［12－13］，而甘丙肽可能正是通過與這些遞質(zhì)及其受體的相互作用，參與了抑郁癥的發(fā)生發(fā)展［4，14］。此前的研究發(fā)現(xiàn)，光剝奪可以導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類遞質(zhì)的水平下降［3］，而本研究更進(jìn)一步明確了光剝奪后甘丙肽水平的下降。結(jié)合上述結(jié)果，可推測光剝奪可能通過影響了包括甘丙肽在內(nèi)的多種神經(jīng)遞質(zhì)的水平，導(dǎo)致了抑郁狀態(tài)的發(fā)生。

Gonzalez等［3］的研究顯示光剝奪導(dǎo)致了藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元等單胺能神經(jīng)元處于“凋亡過程中的初級(jí)階段”，其結(jié)論是依據(jù)PARP p85免疫熒光染色的圖片。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，PARP被酶切為分子量85kDa(即PARP p85)和25kDa的兩個(gè)片段，從而喪失其DNA修復(fù)功能，因此PARP p85的水平上升可用來反映凋亡發(fā)生情況［15］。參照該論文［3］的圖片，本研究偶見類似的PARP p85弱陽性細(xì)胞，但數(shù)量極少且熒光強(qiáng)度很弱，很難與背底染色區(qū)別;同時(shí)在光剝奪組和光照組均有發(fā)現(xiàn)，分布區(qū)域也不局限于中縫背核、藍(lán)斑處。因此，提示PARP p85弱陽性細(xì)胞并不能反映出神經(jīng)元處于凋亡前期狀態(tài)，光剝奪后是否存在神經(jīng)元凋亡有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，提示本研究觀察到光剝奪后大鼠中縫背核、藍(lán)斑處甘丙肽水平的下降并非由神經(jīng)元凋亡引起，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究成功建立了大鼠的光剝奪模型，進(jìn)一步證實(shí)了甘丙肽與抑郁癥之間可能存在聯(lián)系，為了解SAD以及其它類型抑郁癥的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路。但是，甘丙肽只是中樞諸多遞質(zhì)中的一種，光剝奪是否還影響了其它遞質(zhì)、遞質(zhì)水平變化的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of long-tim e light dep rivation on depression and the possible pathologicalmechanism.

WANGWei，ZHAO Guangyu，LIU Yu，LIZhuyi，SU Changjun.Department of Neurology，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，17West Changle Road，Xian 710032.China.Tel:029 －84777743.

ObjectiveTo investigate the impact of long－time light deprivation on depression－like behavior，and probe into the possible pathologicalmechanism with focus on central galanin level and apoptosis.MethodsTwelve rats were kept in constant darkness for 6 weeks and 12 rats housed in a normal light－dark schedule served as controls.The immobility time in forced swim test(FST)was used to determine the extent of depression and immunofluorescence staining was employed to examine galanin expression aswell as apoptotic neurons in the ratbrain.ResultsRats from the light deprivation group showed a decrease in both body－weightgain and food－intake compared with control rats ［(239.23 ±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］.FST data showed that rats treated with 6 week－light deprivation showed a longer immobility time compared with controls ［(135.81 ±8.84)s vs(56.33 ±7.26)s，P＜ 0.05］.Immunofluorescence staining detected a reduction of galanin level，as evidenced by integral optical density，in the dorsal raphe nucleus and locus coeruleus［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13 ±2.68)，P＜0.01］，but not detect any apoptotic cell in the brain of rats treated with 6 week－light deprivation.ConclusionLong－time light deprivation leads to depression－like behavior in rats.The down－regulation of galanin level in the rat brainmay be involved in long－time light deprivation－induced depression－like behavior.

Depression Galanin Light deprivation

R749.4

A

☆國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):30970945)，“973”課題資助項(xiàng)目(編號(hào):2007CB512303)

* 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)科(西安 710032)

(E－mail tdneurob@fmmu.edu.cn)

2010－10－22)

(責(zé)任編輯:曹莉萍)

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