地榆、地榆片、地榆炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳新玉 ，李健和 ，黎銀波 ，易利丹

1.郴州市第三人民醫(yī)院藥劑科，湖南郴州 423000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙 410011；3.湖南省藥品檢驗(yàn)所，湖南長(zhǎng)沙 410001

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長(zhǎng)葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根[1]。其性微寒、苦、澀、酸，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效，臨床主要用于便血、痔血，血痢、崩漏，水火燙傷，癰腫瘡毒等癥。收載于《中國(guó)藥典》2005年版一部。地榆中含有多種化學(xué)成分，莖含槲皮素、山柰素、熊果酸、維生素C；花含矢車菊苷、矢車雙菊苷；根含鞣質(zhì)和三萜皂苷，此外，還有黃酮、蒽醌、甾體類等多種化學(xué)成分[2-3]。為有效控制其質(zhì)量,在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]，對(duì)鞣質(zhì)含量測(cè)定法進(jìn)行了改進(jìn)，并研究建立了沒食子酸的高效液相含量測(cè)定方法。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

北京普析通用TU-1901紫外分光光度計(jì)；日本島津LC-2010A高效液相色譜儀。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，磷酸為分析純；水為重蒸水；沒食子酸對(duì)照品（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)為 110831-200302）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)的含量測(cè)定

2.1.1 干酪素干擾試驗(yàn) 按 《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X B鞣質(zhì)含量測(cè)定方法，測(cè)定了地榆中鞣質(zhì)的含量，在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)所用的吸附劑干酪素，干擾測(cè)定結(jié)果，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-6]。為此，對(duì)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的干酪素（化學(xué)純，批號(hào)：H20060330、20080516）進(jìn)行了空白干擾試驗(yàn)，方法：稱取上述兩批干酪素0.60 g，各5份，分別置100 ml錐形瓶中，精密加水25 ml，密塞，其余操作按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X B鞣質(zhì)含量測(cè)定方法，測(cè)定“不被吸附多酚”含量，以水為空白，測(cè)定干酪素的吸收值，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 干酪素的空白干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 測(cè)定方法 取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.4 g，精密稱定，照鞣質(zhì)含量測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄 X B），以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅤA）,在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在“不被吸附的多酚”測(cè)定中，同時(shí)作空白試驗(yàn)校正，計(jì)算即得。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 十批地榆、地榆片、地榆炭鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

2.2 沒食子酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil C18（200 mm×4.6 mm，10 μm）；柱溫：30℃；以甲醇-0.05% 磷酸溶液（1.5∶98.5）為流動(dòng)相；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加水制成每1 ml約含30 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加10%鹽酸溶液10 ml，置沸水浴中加熱回流3 h，取出，放冷，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用水適量洗滌容器和殘?jiān)匆簽V入同一量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。空白溶劑、對(duì)照品、供試品色譜圖分別見圖1。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.036 2 mg/ml的沒食子酸對(duì)照品溶液 1、3、5、7、9、15 μl，測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=2 576 229.30C+325.25，r＝1.000 0。 結(jié)果表明：沒食子酸在0.036 2～0.543 μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一份供試品溶液（批號(hào)：20100120）10 μl， 重復(fù)進(jìn)樣 5 次， 測(cè)定其峰面積，RSD 為0.19%。結(jié)果表明：本方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一份供試品溶液（批號(hào)：20100120）10 μl，于 0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，RSD為0.38%，結(jié)果表明：供試品溶液在12 h內(nèi)峰面積值基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：20100120），按含量測(cè)定項(xiàng)下方法，測(cè)定6次（n=2），RSD為0.70%，結(jié)果表明：本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量為1.52%的樣品約0.1 g，共5份，分別精密加入沒食子酸對(duì)照品溶液（0.531 6 mg/ml）3.0 ml，即1.594 8 mg，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：本方法加樣回收率良好。

表3 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.10 耐用性試驗(yàn) 按擬定的方法，采用不同的液相色譜儀（LC-2010A；Agilent 1100），使用不同品牌的色譜柱(大連依利特公司Hypersil C18柱；菲羅門公司Phenomenex C18柱）對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD為0.9%。結(jié)果表明：本方法耐受性良好。

2.2.11 檢測(cè)限考察 精密稱取對(duì)照品10.96 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置250 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，按上述選定的色譜條件，取10 μl，注入液相色譜儀中，測(cè)定，其信噪比約為3∶1，故確定其檢測(cè)限為0.175 ng。

2.2.12 定量限考察 精密稱取對(duì)照品10.96 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置250 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置10 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，按上述選定的色譜條件，取10 μl，注入液相色譜儀中，測(cè)定，其信噪比約為10∶1，故確定其定量限為0.44 ng。

2.2.13 地榆、地榆片、地榆炭中沒食子酸含量測(cè)定 取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加10%鹽酸溶液10 ml，置沸水浴中加熱回流3 h，取出，放冷，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用水適量洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。另精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加水制成每1 ml約含30 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算即得。十批地榆、地榆片、地榆炭的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 十批地榆沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 干酪素干擾試驗(yàn)

干酪素的空白吸收值較大，相同生產(chǎn)廠家不同生產(chǎn)批號(hào)的產(chǎn)品其吸收值的差異較大，而《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X B鞣質(zhì)含量測(cè)定方法中“不被吸附多酚”的測(cè)定中，未規(guī)定干酪素的空白試驗(yàn)，因此，對(duì)“不被吸附多酚”的含量測(cè)定結(jié)果影響較大，導(dǎo)致樣品中鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果偏低，不能準(zhǔn)確反映鞣質(zhì)的實(shí)際含量。建議對(duì)《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X B鞣質(zhì)含量測(cè)定中的“不被吸附多酚”項(xiàng)下，明確規(guī)定干酪素的空白試驗(yàn)。

3.2 最大吸收波長(zhǎng)選擇

精密稱取沒食子酸對(duì)照品10.28 mg，置100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液，以流動(dòng)相為空白，按紫外分光光度法在220～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描（儀器：TU-1901，狹縫：1.0；中速掃描），結(jié)果在271.5 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-6]。參照《中國(guó)藥典》2005年版一部品種五倍子的沒食子酸含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)，并結(jié)合本試驗(yàn)紫外掃描結(jié)果，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為272 nm。

3.3 提取溶劑及提取方法的研究

為了純化供試品溶液，保護(hù)色譜柱，減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，我們對(duì)樣品的預(yù)處理進(jìn)行了研究，分別對(duì)不同溶劑(甲醇、水、5%鹽酸溶液、10%鹽酸溶液、15%鹽酸溶液)，不同提取方法（加熱回流法、超聲提取法）進(jìn)行了比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以水為提取溶劑，加熱回流提取，供試品溶液黏稠，濾過速度慢，且測(cè)定的成分是游離的沒食子酸，含量約為0.22%，故不宜采用此提取方法。以甲醇為提取溶劑，超聲提取，因樣品中大多數(shù)沒食子酸是以可水解鞣質(zhì)的形式存在，測(cè)定的是少量游離沒食子酸的含量，結(jié)果為0.17%，故也不宜采用此提取方法。以10%鹽酸溶液提取，再用乙醚萃取，因操作繁瑣，所測(cè)成分損失較大，含量結(jié)果為1.56%，故也不宜采用此提取方法。以5%鹽酸為提取溶劑，加熱回流提取，其操作簡(jiǎn)便，HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰相對(duì)較多，供試品溶液色澤較深，樣品中的沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果偏低，含量結(jié)果為1.18%，故也不宜采用此提取方法。以10%鹽酸為提取溶劑，加熱回流提取，其操作簡(jiǎn)便，供試品溶液色澤清亮，HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰少，無干擾，且樣品中的沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果較高，含量結(jié)果為1.80%，因此，選擇10%的鹽酸為提取溶劑。以15%鹽酸為提取溶劑，加熱回流提取，其操作簡(jiǎn)便，HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰少，無干擾，且樣品中的沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果較高，含量結(jié)果為1.70%，經(jīng)與10%鹽酸提取液相比較，差別不大。以10%鹽酸為提取溶劑，超聲提取，其操作簡(jiǎn)便，HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰少，無干擾，但樣品中的沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果偏低，含量結(jié)果為0.14%。因超聲提取未達(dá)到水解的效果，不宜采用。

3.4 提取時(shí)間的選擇

取本品粉末（過4號(hào)篩）約0.2 g，共3份，精密稱定，分別置錐形瓶中，加10%鹽酸15 ml，置沸水浴中加熱回流，提取時(shí)間分別為 2、3、5 h，取出，放冷，濾過，濾液置 100 ml量瓶中，用水分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗滌液濾入同一量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。按上述選定的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明樣品經(jīng)加熱回流提取3 h后，沒食子酸含量幾乎不再增加，表明沒食子酸已基本提取完全，因此，確定最佳提取時(shí)間為3 h。

總之，在地榆、地榆片、地榆炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中分別采用UV法測(cè)定鞣質(zhì)的含量和HPLC法測(cè)定沒食子酸的含量，兩種測(cè)定方法均靈敏、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為地榆、地榆片、地榆炭的質(zhì)量控制方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 [M].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社出版,2005：83.

[2]袁振海,孫立立.地榆現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(3)：91-92.

[3]曹愛民,張東方.地榆中皂苷類化合物分離、鑒定及其含量測(cè)定[J].中草藥,2003,34(5)：397-399.

[4]謝道剛,宋光志,劉靜.鞣質(zhì)含量測(cè)定法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄XB）方法學(xué)驗(yàn)證[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2006 8(6)：50-53.

[5]孫立立,江波,袁振海,等.HPLC測(cè)定地榆飲片中沒食子酸的含量[J].中成藥,2006,28(8)：1144-1146.

[6]張秀杰,潘明寬.地榆中游離及水解沒食子酸含量測(cè)定[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2002,21(5)：15-17.