RP-HPLC測定元明丹中士的寧的含量

朱祥松，張 俊

1.鄂州市食品藥品監(jiān)督檢驗所，湖北鄂州 436000；2.鄂州市中心醫(yī)院康復(fù)科，湖北鄂州 436000

元明丹系由馬錢子、三七、西紅花、血竭、當(dāng)歸等多味中藥組成的醫(yī)院傳統(tǒng)驗方制劑，具有活血祛瘀、消腫化瘤、解毒止痛的功效，用于白血病、肉瘤癌、筋骨疼痛及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥。馬錢子中所含的士的寧既為有效成分又具有毒性，安全范圍窄，過量使用常會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)[1]，應(yīng)嚴(yán)格控制其用量。本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對士的寧僅有薄層色譜定性鑒別，為保證用藥安全和制劑質(zhì)量，本文采用RP-HPLC法對元明丹中士的寧進(jìn)行定量分析，方法靈敏、簡便、準(zhǔn)確，可用于元明丹的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

DIONEX Ultimate3000高效液相色譜儀：LPG3400A泵，VDW3100紫外檢測器，Chromeleon色譜工作站；BS21S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；Aquapro純水儀(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

士的寧對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號110705-200005）；元明丹（鄂州市某醫(yī)院提供，批號為090201，090401， 090411）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為 DIONEX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.3%三乙胺溶液（磷酸調(diào) pH=2.6）（9∶91）為流動相，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，檢測波長：254 nm；進(jìn)樣體積：20 μl。理論塔板數(shù)按士的寧峰計算不少于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 稱取士的寧對照品10.14 mg，置20 ml量瓶中，加三氯甲烷使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液3 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得

2.2.2 供試品溶液 取元明丹適量，粉碎，過二號篩，取粉末0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氫氧化鈉試液3 ml，混勻，放置30 min，精密加三氯甲烷20 ml，密塞，稱定重量，置水浴中回流提取2.5 h，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，分取三氯甲烷提取液，用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 ml，置60℃水浴揮干，殘渣用甲醇溶解定容至5.00 ml，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例制備不含馬錢子的陰性對照樣品，按照“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl，注入色譜儀，同法測定，結(jié)果供試品溶液與對照品溶液主峰的保留時間一致，士的寧峰與其他峰完全分離，峰形理想，陰性對照無干擾。見圖1。

2.4 線性關(guān)系

精密量取對照品儲備液5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液⑤；精密量取對照品溶液⑤1、2、3、4 ml， 分別置 5 ml量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品溶液①、②、③、④。將對照品溶液①～⑤用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，依次進(jìn)樣 20 μl，測定峰面積。 以士的寧的峰面積（Y），分別對其進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=33.226 1X+11.139 5（r=0.999 7）。 結(jié)果表明，士的寧在0.405 6～2.028 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μl，測定士的寧峰面積，RSD 為 0.96%（n=6）。

2.6 重復(fù)性試驗

取批號為090401供試品6份，分別制備成供試品溶液，依法測定，計算含量。士的寧平均含量為1.63 mg/g，RSD為1.9%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將供試品溶液常溫放置， 分別于 0、2、4、6、8，10 h 進(jìn)樣20 μl，測定士的寧峰面積，RSD 為 1.5%（n=6）。 結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

精密量取對照品儲備液5份，每份各1 ml，分置錐形瓶中，于60℃水浴上揮干；精密稱取“2.6”項下的已測定含量的元明丹5份分別至錐形瓶中，每份約0.35 g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=5）

2.9 樣品含量測定

取本品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。

表2 元明丹中士的寧的測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 提取方法

提取士的寧常采用堿性三氯甲烷水浴回流的方法[2,4]，比較氫氧化鈉試液和濃氨試液兩種不同堿化試劑的提取效果，結(jié)果顯示采用氫氧化鈉試液效果較好；比較回流提取2.0、2.5、3.0 h，發(fā)現(xiàn)回流2.5 h已提取完全。

3.2 流動相的選擇

采用文獻(xiàn)[4-8]報道的乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液 (用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.8)組成流動相時，發(fā)現(xiàn)士的寧峰與相鄰峰不易分離。采用本文流動相時，利用三乙胺調(diào)節(jié)峰形，加入磷酸改善基線漂移現(xiàn)象，此時，樣品中士的寧峰與其他峰完全分離，峰形較好。

[1]馬密霞,胡文祥,劉接卿,等.馬錢子屬植物的藥理毒理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,(12)：1725-1728.

[2]國家藥典委員會.中國藥典 [S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：34.

[3]楊春靜,郜娜,姬廣山.RP-HPLC法測定強(qiáng)筋健骨片中馬錢子堿和士的寧的含量[J].中國藥師,2010,13(4)：519-520.

[4]宋玉國,彭振宇,張新茹.HPLC法測定風(fēng)濕福音丸中馬錢子堿、士的寧的含量 [J].中國藥事,2010,24(5)：507-513.

[5]丁紅仙.高效液相色譜法測定十三味馬錢子丸士的寧的含量[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,33(3)：425-426.

[6]王歆君,劉進(jìn)疆,王芳,等.胃爾康片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].西北藥學(xué)雜志,2009,24(6)：451-452.

[7]馮益民.高效液相色譜法測定平消片中士的寧含量 [J].中國藥業(yè),2009,18(12)：50.

[8]閏雪生,朱建偉,江波,等.馬錢子與甘草配伍前后士的寧和馬錢子堿的HPLC 分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(10)：18-19.