胰腺大部切除法制作大鼠高血糖模型的實(shí)驗(yàn)研究

李 勇 ，章樂(lè)虹

1.四川省雅安市人民醫(yī)院普外科，四川雅安 625000；2.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科，廣東廣州 510260

目前，糖尿病及其并發(fā)癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，進(jìn)一步深入探討糖尿病發(fā)病機(jī)制及治療方式有賴于理想的動(dòng)物模型的建立。因而，研究臨床糖尿病前期機(jī)體的相關(guān)變化及代償情況無(wú)疑能為進(jìn)一步探索糖尿病發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療方法提供更多的資料。為此，本文設(shè)計(jì)使用胰腺大部切除法制作大鼠高血糖模型，并對(duì)制作方法及相關(guān)生化、形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠60只(雌雄不拘，廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(200±30)g。大鼠隨機(jī)分為三組：胰腺切除加高糖飲食組（P+H組，n=30）；胰腺切除組（P組，n=20）；假手術(shù)加高糖飲食組（H 組，n=10）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

胰腺切除加高糖飲食組（P+H組）行胰腺大部切除術(shù)，按3.5 ml/100 g體重，使用10%水合氯醛作大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉后，無(wú)菌狀態(tài)下開(kāi)腹，切除大鼠胰腺＞90%，切除范圍包括大網(wǎng)膜、脾臟及十二指腸曲中大部分胰腺組織。術(shù)后肌肉注射青霉素5萬(wàn)U/100 g三次，并予高糖飲食飼養(yǎng)（基礎(chǔ)飼料為常規(guī)飼料，蛋白、脂肪、糖的比例分別為23.4%、4.4%、54.6%，予20%糖水作為飲用水）。胰腺切除組（P組），手術(shù)及基礎(chǔ)飼料同胰腺切除加高糖飲食組，但飲用水中不加糖。假手術(shù)高糖飲食組（H組），開(kāi)腹后不切除胰腺僅作脾臟切除，其余處理同胰腺切除加高糖飲食組。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

血糖變化：三組大鼠均于術(shù)后每24小時(shí)使用微量血糖儀測(cè)定空腹末梢血糖（尾部或耳部針刺取血），連續(xù)三次，72 h后每周測(cè)量一次直至術(shù)后第12周，測(cè)量前大鼠禁飲食（清晨起禁食）8 h。術(shù)后2 d起，連續(xù)二次空腹血糖（FBG）≥7.0 mmo1/L且無(wú)連續(xù)二次空腹血糖≥16.67 mmo1/L為高血糖模型，出現(xiàn)連續(xù)二次FBG≥16.67 mmo1/L為糖尿病模型[1-4]。

血胰島素及體重變化：每15天斷尾取血使用固相放免法（北京東亞免疫技術(shù)研究所提供）測(cè)胰島素同時(shí)稱量體重變化。

糖耐量反應(yīng)：術(shù)后30 d，取三組大鼠測(cè)定空腹血糖后即按體重0.5 g/100 g灌喂葡萄糖，隨后分別測(cè)定0.5、1.0、3.0 h血糖。

HE染色：取正常及病程不同階段大鼠胰腺、肝、腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

免疫組化檢測(cè)：抗胰島素抗體，用SABC法（一抗及試劑盒均由武漢博士德公司提供）對(duì)大鼠胰腺石蠟切片進(jìn)行染色，檢測(cè)beta細(xì)胞數(shù)量及功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血糖變化

三組大鼠血糖隨時(shí)間的變化關(guān)系見(jiàn)表1。其中P+H組20只大鼠術(shù)后72 h死亡2只，以后死亡1只（術(shù)后腸梗阻），成糖尿病模型（出現(xiàn)連續(xù)二次FBG≥16.67 mmo1/L）4只，其余13只均成高血糖模型，成高血糖模型率65%，成糖尿病模型率20%。單純胰腺切除組（P組）在術(shù)后24 h也同樣出現(xiàn)明顯血糖升高，前48 h空腹血糖與P+H組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但術(shù)后72 h起血糖即逐漸下降至接近正常水平，未出現(xiàn)糖尿病模型，有三只成高血糖模型，成高血糖模型率15%。假手術(shù)高糖飲食組（H組）術(shù)后空腹血糖變化不明顯，未出現(xiàn)糖尿病模型及高血糖模型。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中成模動(dòng)物無(wú)致死性低血糖等的發(fā)生，均未使用胰島素治療。

表1 三組大鼠胰腺大部分切除后血糖情況（mmol/L）

2.2 空腹血胰島素水平變化

三組大鼠胰島素水平隨時(shí)間的變化關(guān)系見(jiàn)表2。P+H組血胰島素水平最低、H組則最高、P組介于兩者之間。兩兩均數(shù)的t檢驗(yàn)顯示P+H組與P組及H組比較有顯著性差異（P＜0.01），而P組與H組比較亦低于H組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.3 糖耐量反應(yīng)

術(shù)后2個(gè)月，三組大鼠糖耐量反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3，示P組對(duì)糖刺激耐受低于H組，給糖前兩者血糖濃度無(wú)顯著性差異，但給糖后30、60、180 min P組血糖濃度均高于H組（P＜0.01）；而P+H組血糖則始終高于另兩組。

表2 三組大鼠胰腺大部分切除后血胰島素變化情況（mU/L）

表3 三組大鼠胰腺大部分切除術(shù)后2個(gè)月糖耐量試驗(yàn)結(jié)果（mmol/L）

2.4 HE染色結(jié)果

P+H組（圖1）高血糖模型大鼠胰島有不同程度萎縮、體積縮小，未見(jiàn)明顯胰島纖維化及胰島分布稀疏等改變，在糖尿病模型大鼠中也出現(xiàn)類似改變。P組（圖2）可見(jiàn)胰島體積增大，胰島細(xì)胞肥大。H組中也見(jiàn)部分大鼠胰島呈類似改變。

2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

P組及H組在術(shù)后3個(gè)月beta細(xì)胞的胰島素染色較P+H組增強(qiáng)，beta細(xì)胞數(shù)量亦較后者為多（圖3～5）。

3 討論

國(guó)內(nèi)外糖尿病模型大致分為實(shí)驗(yàn)性和自發(fā)性糖尿病模型，前者多采用鏈脲霉素（STZ）等胰島損傷性藥物制備。但是，糖尿病本身的類型多樣，除原發(fā)性糖尿病外，胰腺損傷、內(nèi)分泌疾病、藥物、感染等多種因素均可致繼發(fā)性糖代謝異常，而這些病變則難以用前述模型模擬。并且，糖尿病發(fā)病過(guò)程是一個(gè)漸進(jìn)、連續(xù)的過(guò)程，出現(xiàn)臨床癥狀的糖尿病已是機(jī)體代償機(jī)制不足以彌補(bǔ)各種病理因素作用的累積結(jié)果。

3.1 動(dòng)物糖尿病模型制作方法

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型的制備多使用化學(xué)藥物（鏈脲霉素、四氧嘧啶等）引起胰島beta細(xì)胞損傷來(lái)完成，按不同的濃度及給藥方式可以模擬出類似體內(nèi)1、2型糖尿病環(huán)境[1-4]。對(duì)手術(shù)切除法制模在不同的文獻(xiàn)報(bào)道有差異，有認(rèn)為手術(shù)切除加高糖飲食刺激可制備繼發(fā)性永久性糖尿病模型，國(guó)外報(bào)道則多是對(duì)有遺傳易感性的肥胖大鼠行胰腺大部分切除而獲得[2,5,6]。本實(shí)驗(yàn)采用胰腺切除加高糖飲食法，對(duì)手術(shù)切除范圍有所改進(jìn)，因大鼠胰腺分布散在，按常規(guī)切除脾臟下至十二指腸部位的胰腺范圍不足，且胰腺與脾臟關(guān)第緊密，若保留脾臟則可能增加術(shù)中損傷血管出血的風(fēng)險(xiǎn)且影響切除范圍。因此我們選擇切除包括大網(wǎng)膜、脾臟及十二指腸曲中大部分胰腺組織，同時(shí)剔除位于膽總管外側(cè)胰腺的手術(shù)方式，這樣可以確保有足夠的切除范圍（90%～95%）。手術(shù)死亡率為10%，比傳統(tǒng)切除范圍的死亡率[7]（5%）稍高。在使用高糖飲食上，因大鼠高糖飲食配方及制作過(guò)程較復(fù)雜，故在使用基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上以含20%葡萄糖的自來(lái)水作飲用水替代，此飼料中并無(wú)高脂食物的影響且制作及使用簡(jiǎn)單。制模結(jié)果看，單純胰腺切除組（P組）在術(shù)后48小時(shí)內(nèi)血糖均明顯升高，但術(shù)后72 h起又漸下降至接近正常水平，觀察3個(gè)月內(nèi)無(wú)糖尿病模型產(chǎn)生，出現(xiàn)高血糖模型率僅15%。在隨后的糖耐量試驗(yàn)中P組則顯示胰島素儲(chǔ)備不足，對(duì)糖刺激的耐受力差，這與其它文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近[5,7]。這說(shuō)明大鼠對(duì)物理性的胰島素不足有較強(qiáng)的代償和調(diào)節(jié)能力，在常規(guī)飲食情況下能較快恢復(fù)血糖穩(wěn)定，但對(duì)突發(fā)的高糖飲食刺激則缺乏足夠的耐受和調(diào)控能力。故即使擴(kuò)大切除范圍至90%～95%，單純胰腺大部切除也只能導(dǎo)致短時(shí)間的大鼠血糖升高，因而該方法不適宜作高血糖動(dòng)物模型制備但可作糖耐量異常的動(dòng)物模型制備。在胰腺切除加高糖飲食組（P+H組）術(shù)后即出現(xiàn)血糖升高，觀察3個(gè)月內(nèi)血糖始終維持在較高水平，成高血糖模型率65%，成糖尿病模型率20%，術(shù)后胰島素濃度較另兩組均偏低（P＜0.05,糖耐量反應(yīng)也低于假手術(shù)高糖飲食組（H組）。表明在胰腺大部分切除的基礎(chǔ)上，持續(xù)的高糖飲食刺激可抑制大鼠胰島beta細(xì)胞的代償和調(diào)節(jié)能力，從而形成高血糖狀態(tài)。因本實(shí)驗(yàn)所測(cè)血糖均為空腹血糖且據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1,2,6,8,9]報(bào)道當(dāng)大鼠血糖濃度持續(xù)≥16.67 mmo1/L時(shí)即可產(chǎn)生對(duì)胰島細(xì)胞的損害作用，故我們也選擇以連續(xù)兩次血糖濃度≥16.67 mmo1/L作為判斷是否構(gòu)成糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)多數(shù)大鼠只形成穩(wěn)定的高血糖模型而未達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，這可能與使用加糖飲水替代的高糖飲食對(duì)胰島細(xì)胞的攻擊弱于傳統(tǒng)高糖飲食以及地域差異和觀察時(shí)間還不足夠長(zhǎng)有關(guān)。但這一穩(wěn)定的高血糖大鼠模型正好為研究臨界糖尿病前期病理生理改變及可能的藥物和治療方法干預(yù)提供良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

3.2 胰腺大部切除及高糖飲食對(duì)胰島細(xì)胞的影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)三組受試對(duì)象殘余胰腺組織的病理標(biāo)本及免疫組化分析顯示，在單純胰腺大部切除或單純高糖飲食作用下，在實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)可見(jiàn)胰島有不同程度肥大、增生，beta細(xì)胞的胰島素染色增強(qiáng)、增多。而在胰腺大部分切除的基礎(chǔ)上加用高糖飲食刺激組（P＋H組）則出現(xiàn)相反的改變，部分胰島有萎縮、體積縮小，beta細(xì)胞胰島素染色也弱于P組及H組，這在成糖尿病模型大鼠中尤為明顯。這說(shuō)明在單純胰腺物理?yè)p傷及適度高糖飲食刺激下，胰島會(huì)通過(guò)增生、肥大等方式增加胰島素分泌以彌補(bǔ)體內(nèi)胰島素不足從而維持血糖濃度穩(wěn)定。但在兩種因素同時(shí)作用時(shí)，胰腺的代償已不足以維持血糖濃度穩(wěn)定，機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，這時(shí)殘存胰島超負(fù)荷后即顯示出高血糖狀態(tài)對(duì)胰島的毒性作用，因而出現(xiàn)胰島萎縮、beta細(xì)胞減少等改變，出現(xiàn)這一改變后與高血糖狀態(tài)互為因果、相互促進(jìn)啟動(dòng)糖尿病的進(jìn)程。

4 結(jié)論

單純的胰腺大部分切除或適當(dāng)高糖飲食可刺激胰島細(xì)胞代償性的增生、肥大，而當(dāng)兩者聯(lián)合作用使血糖濃度長(zhǎng)期處于較高狀態(tài)時(shí)則顯示對(duì)胰島細(xì)胞的毒性作用，出現(xiàn)胰島萎縮、beta細(xì)胞減少等改變。

獨(dú)立使用手術(shù)切除大部分胰腺的方法難以制作理想的高血糖大鼠模型，但可制作糖耐量異常的動(dòng)物模型，聯(lián)合手術(shù)切除及高糖飲食刺激可制成穩(wěn)定的高血糖模型，制作方法可靠，成模率高，但制作糖尿病模型則成模率相對(duì)較低。

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