苦參堿改構(gòu)體X抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究

李靜雨，唐安洲，王立升，冉 偉，謝利紅，鐘華林

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530021

鼻咽癌是我國(guó)最常見的頭頸部腫瘤，尤其在兩廣地區(qū)，發(fā)病率更高。目前鼻咽癌的唯一根治性治療手段是放療，但是由于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和放射的局部損傷作用，給進(jìn)一步改善晚期鼻咽癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量帶來了困難[1]，因此需要越來越多的化療手段介入?？鄥A是近年受到關(guān)注的抗腫瘤成分，并且有研究表明其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，如鼻咽癌[2]、肝癌[3]、膀胱癌[4]等，并且在臨床上的應(yīng)用也非常廣泛，但是它的生物利用率并不是特別高。為了使其活性和生物利用度更高，筆者以苦參堿為先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)合成方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，合成了20個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的苦參堿衍生物。苦參堿改構(gòu)體X正是從中初步篩選出的具有抗腫瘤活性的成分，本實(shí)驗(yàn)研究了該藥對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE2體外增殖的影響，并探討其機(jī)制，此研究尚屬首例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2由中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室購得，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)院，由本實(shí)驗(yàn)室接種保存。CNE2細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%滅活胎牛牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、相對(duì)濕度90%，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代。

1.1.2 藥物 苦參堿改構(gòu)體X由廣西大學(xué)王立升教授惠贈(zèng)，化學(xué)名稱14-噻吩基次亞甲基苦參堿。藥物先以無水乙醇溶解，然后用生理鹽水等體積稀釋，過濾除菌，4℃保存。其結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.1.3 試劑和儀器 RPMI-1640改良型培養(yǎng)液購自hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自GIBCO公司,噻唑蘭（MTT）、PBS、DMSO 購自 Sigma公司，凱基 Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和凱基細(xì)胞周期試劑盒。培養(yǎng)瓶購自corninggs，CKX41型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀（美國(guó)RT-2100型）、恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）、電熱鼓風(fēng)干燥箱購自上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠，-86℃超低溫冰箱（美國(guó)Forma公司），Eppendorff 58108型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorff公司），2300型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司），EPICSXL流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司），SCV4A1型超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加苦參堿改構(gòu)體藥液，濃度為 25、50、100、200、400 mg/L，24 h后倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)分別是10×20和10×40。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE2細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞按每孔6×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，于第2天下午加入不同濃度的苦參堿改構(gòu)體藥液，濃度分別為25、50、100、200、400 mg/L，并加入相應(yīng)比例完全培養(yǎng)基共 200 μl；另設(shè)溶劑組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組（調(diào)零孔），除完全培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜外，其中溶劑組加無水乙醇的生理鹽水等體積稀釋液、完全培養(yǎng)基、細(xì)胞，陰性對(duì)照組加細(xì)胞，調(diào)零孔只加完全培養(yǎng)基、MTT和二甲基亞砜。每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4h后棄去上清液，加入150μl二甲基亞砜，輕輕振蕩10min，使結(jié)晶物完全溶解，于570 nm波長(zhǎng)處在熒光酶聯(lián)分析儀上測(cè)光吸收值（A 值），計(jì)算抑制率（IR）。IR（%）=（對(duì)照孔 A 值-實(shí)驗(yàn)孔A值）/對(duì)照孔A值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加苦參堿改構(gòu)體藥液，濃度為 25、50、100、200、400 mg/L，并加入相應(yīng)比例完全培養(yǎng)基至5 ml，24 h后依據(jù)試劑盒說明書收集細(xì)胞送檢。以增殖指數(shù)分析細(xì)胞的增殖活性：PI=（S期細(xì)胞數(shù)+G2/M期細(xì)胞數(shù)目）/三期細(xì)胞數(shù)目總和。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

見圖 1～3。

如圖1所見，未干預(yù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈延展和扁平，細(xì)胞均質(zhì)而透明，核膜核仁輪廓明顯，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，生長(zhǎng)旺盛。在藥物干預(yù)之后，如圖2、3可見細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，隨濃度遞增表現(xiàn)愈明顯。

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果（MTT）

由表1可見隨著加藥濃度增加，苦參堿改構(gòu)體對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有明顯抑制作用，最大可達(dá)97.9%，經(jīng)SPSS[5]可求得改構(gòu)體對(duì)細(xì)胞株CNE2的IC50為（106.378±0.825）。而由表2可見，對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞苦參堿改構(gòu)體基本上沒有抑制作用，排除溶劑的干擾，其抑制率最大僅7.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同濃度處與CNE2的抑制率，故可以認(rèn)為苦參堿改構(gòu)體的具有特異性抗腫瘤作用。

2.3 細(xì)胞周期分布

用流式細(xì)胞儀分析五個(gè)濃度梯度的苦參堿改構(gòu)體藥液對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2周期改變的影響。其中，對(duì)照組S期比例為15.69%、增殖指數(shù)為28.7，加藥組的S期比例由25～400 μg/ml分別為 19.66%、28.15%、22.60%、29.28%、29.07%，對(duì)照組明顯低于各個(gè)濃度的加藥組，可見該藥通過細(xì)胞周期抑制腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控點(diǎn)很可能就在S期。

表1 不同濃度苦參堿改構(gòu)體作用48 h后對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖影響

表2 不同濃度苦參堿改構(gòu)體作用48 h后對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的增殖影響

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

濃度在25、50 μg/ml處已開始出現(xiàn)凋亡，凋亡率分別為27.28%、28.69%；100、200 μg/ml處明顯出現(xiàn)凋亡， 細(xì)胞凋亡超過了50%；濃度為400 μg/ml時(shí)凋亡率已達(dá)到89.71%，表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用。

3 討論

苦參堿是純天然生物堿類藥物，其制劑已廣泛用于治療慢性肝炎和肝纖維化，并表現(xiàn)出了一定的抗癌作用，針對(duì)其抗腫瘤特點(diǎn)加強(qiáng)相關(guān)衍生物和新制劑的研究，可以充分發(fā)揮傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤特性[6]。研究所用苦參堿改構(gòu)體X由廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院王立升教授惠贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化、MTT檢測(cè)藥物抑制率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，筆者發(fā)現(xiàn)苦參堿改構(gòu)體有很強(qiáng)的腫瘤抑制作用，并且不損傷正常細(xì)胞。李海英等[2]研究苦參堿抗鼻咽癌細(xì)胞CNE2作用時(shí)，其48 h IC50為710 μg/ml，而此改構(gòu)體為（106.378±0.825） μg/ml，僅為苦參堿的七分之一，其抗鼻咽癌藥效遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于苦參堿。

細(xì)胞周期是細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，許多化療藥物就是通過阻滯正常細(xì)胞周期的激活靶點(diǎn)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖的目的[7]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞加藥前后細(xì)胞周期時(shí)相分布結(jié)果顯示：苦參堿改構(gòu)體處理細(xì)胞24 h后，各濃度組的細(xì)胞周期S期細(xì)胞含量與對(duì)照組相比明顯增加（P＜0.05），隨濃度遞增含量亦隨之增加，表現(xiàn)出細(xì)胞被阻滯于S期，從而抑制細(xì)胞分裂，參與完成其細(xì)胞增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，各濃度組具有明顯的促進(jìn)凋亡作用（P＜0.05），其凋亡率表現(xiàn)出了劑量依賴性，并與細(xì)胞周期S期細(xì)胞含量大小一致。流式細(xì)胞儀結(jié)果結(jié)合細(xì)胞形態(tài)變化示此苦參堿改構(gòu)體有體外誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2凋亡的作用。

細(xì)胞周期作為一個(gè)抗腫瘤藥物作用的新靶點(diǎn)正在被越來越多的研究者關(guān)注和認(rèn)可[8-9]，被認(rèn)為可以最大限度地減少耐藥、突變及毒性的發(fā)生機(jī)會(huì)[10]，通過本實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)苦參堿改構(gòu)體可以明顯地阻滯細(xì)胞增殖于S期，表現(xiàn)出顯著的促細(xì)胞凋亡作用，而且不損傷正常細(xì)胞。為提高藥物的抗腫瘤活性和選擇性作用，還需要進(jìn)一步從分子水平探討其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的影響，并找出其具體的作用靶點(diǎn)，從而在整體上了解其作用機(jī)制。

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