銀杏內(nèi)酯對過氧化氫損傷的皮層神經(jīng)元和SH-SY5Y細胞親環(huán)蛋白A(CypA)表達的影響

楊俊霞，楊惠超，王東江，潘志強

1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室&江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州 221000；2.北京金康馳醫(yī)藥投資有限公司，北京 100142；3.河北省臨漳縣人民醫(yī)院胸外科，河北臨漳 056600

親環(huán)蛋白A(CypA)是親環(huán)蛋白家族主要成員，于1984年在哺乳動物細胞中首次被發(fā)現(xiàn)，是免疫抑制劑環(huán)孢酶素A(CyclosporinA,CsA)在細胞內(nèi)的作用靶點[1]，具有肽基脯氨酸順/反異構(gòu)酶活性。研究顯示，CypA在多種腫瘤細胞中高表達[2-6]，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。最近研究證實氧化應(yīng)激和缺血時，CypA對神經(jīng)元有保護作用[7-8]。

以往的研究表明，銀杏內(nèi)酯(ginkgolides,Gin)對氧糖剝奪和過氧化氫損傷的神經(jīng)元有良好的保護作用[9-12]，但其保護機制是否與CypA的表達有關(guān)尚未見報道。為此，本研究以過氧化氫損傷的皮層神經(jīng)元為模型觀察Gin對CypA表達的影響，為進一步證實在過氧化氫損傷時Gin與CypA表達的關(guān)系，本研究還采用了過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞模型，進一步證實了過氧化氫損傷時，Gin對細胞的保護作用與CypA表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Gin（長沙上禾生物科技有限公司）、DMED培養(yǎng)基、Neurobasal Medium、B27(Gibco,USA)、胎牛血清(杭州四季青生物公司)、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物L(fēng)-多聚賴氨酸、MTT、胰酶(Sigma,USA)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、Tris(上海朝瑞生物技術(shù)公司進口分裝)、PVDF 膜(Bio-Rad Laboratories,USA)、抗 β-actin單克隆抗體(Sigma公司)、抗CyPA多克隆抗體 (Biomol,USA)、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology,USA）免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑 ECL（PIERCE），Kodak 膠片(USA)，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 過氧化氫損傷的皮層神經(jīng)元模型的建立

取胎齡為13～15 d的ICR小鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，在D-Hank′s平衡鹽溶液中漂洗3次，盡量剔除腦膜，剪碎后用終濃度為0.25%胰酶，37℃消化10 min，離心，棄去上清，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1.5×109cell/L密度的細胞懸液，接種于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。第二天換成含2%B27的Neurobasal繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至第7天，換成無血清DMEM培養(yǎng)基，加入新鮮配制的 H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細胞共同孵育2 h后測細胞活力。

1.3 過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞模型的建立

取指數(shù)增長期的SH-SY5Y細胞，將完全培養(yǎng)基換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，加入新鮮配制的H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細胞共同孵育2 h后測細胞活力。

1.4 分組和藥物處理

實驗分為對照組(Control)、H2O2損傷組（Model）和 H2O2損傷加Gin組(Gin)。Gin用1%的二甲基亞砜溶液配制(濃度為 42.4 mg/L[9-12])，加 H2O2前 12 h加入培養(yǎng)基,使終濃度為42.4 mg/L；對照組、H2O2組同時加入相應(yīng)量的二甲基亞砜溶液。H2O2處理前去除各組原細胞培養(yǎng)液，換成2 ml DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，處理后即檢測細胞活力。用于Western Blot分析的細胞處理后換成完全培養(yǎng)基12 h后提取蛋白。

1.5 細胞存活率測定(MTT法)

MTT法檢測細胞活力的原理是利用活細胞線粒體脫氫酶將MTT鹽還原成藍紫色的甲瓚顆粒，以顆粒溶解后呈現(xiàn)的顏色深淺反映細胞活性。各組細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)H2O2處理后，用D-Hank's液洗2遍，每孔加入1 g/L的MTT溶液100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中4 h，然后再加入100 μl，20%SDS，37℃孵育 20～24 h，用全自動酶標(biāo)儀于 570 nm波長測吸光度值(A)，A值越大說明細胞活力越好。每組均設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)兩次以上。

1.6 Western Blot檢測CypA的表達

將培養(yǎng)于96孔板的各組細胞 (處理神經(jīng)元與SH-SY5Y細胞的H2O2終濃度分別為0.1、0.2 mmo/L)用冰冷的PBS洗滌兩遍，每空加入0.6 ml蛋白裂解液，刮取細胞，搜集到1.5 ml EP管，冰上放置30min，超聲粉碎細胞，13000r/min離心10min，取少量上清液用考馬斯亮藍比色法測蛋白濃度，30 μg總蛋白量分裝成一管，-20℃保存。

制膠：配制12%分離膠溶液7.5 ml(去離子水2.625 ml，Tris·HCl pH8.8 1.875 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 3 ml，10%AP 45 μl，TEMED 15 μl)，現(xiàn)將上三樣混勻后，取出 0.250 ml加入 5 μl 10%AP和5 μl TEMED迅速混勻，打入板中，封底，約10 min后，加入混勻的其他成分，輕輕地在頂層加入幾毫升去離子水至玻片齊平。聚合完成(約30 min)之后，倒掉覆蓋液體，用吸水紙吸干凝膠上部的殘存液體。配制5%濃縮膠2 ml(去離子水 1.2 ml,Tris·HCl pH6.8 0.48 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 0.25 ml，10%AP 19.2 μl，TEMED 3.8 μl)，插入梳子，小心避免混入氣泡，室溫下約15 min后聚合。

電泳：將樣品蛋白與適量上樣緩沖液混勻，100℃水浴加熱5 min。將制備好的凝膠放在電泳槽上。上下槽均加入1×電泳緩沖液，檢查是否滲漏。繼續(xù)向上槽內(nèi)添加電泳緩沖液直至充滿上樣孔；拔去梳子。在加樣指導(dǎo)器的幫助下按次序上樣，并加上預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量蛋白質(zhì)分子。濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，至溴酚蘭抵達分離膠底部后，斷開電源。切下與CypA蛋白分子量（18 kD)對應(yīng)的分離膠，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中待轉(zhuǎn)膜用。

轉(zhuǎn)膜：將電泳后的凝膠、甲醇浸濕過的PVDF膜(大小與分離膠相似或略大)、多孔濾墊、厚濾紙用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡15min。采用BIO-RAD電泳儀，用二張厚濾紙貼于兩張多孔濾墊，將PVDF膜、凝膠夾于中間。PVDF膜朝正極，0℃、350 mA恒流轉(zhuǎn)移2 h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜取出剪去一角以標(biāo)記膜的方向，用1×TBS溶液漂洗3遍，每遍10 min。

抗原抗體反應(yīng)：PVDF膜轉(zhuǎn)入一盛有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下?lián)u床包被2 h。封閉結(jié)束后，將膜浸入加有一抗(抗 CypA 抗體 1：25 000 稀釋，抗 β-actin 抗體 1：10 000 稀釋)的新鮮配制的封閉液，4℃過夜。次日，用TBS溶液將膜漂洗3遍，每遍5 min。向膜的正面滴加含有二抗的封閉液，室溫搖床反應(yīng)2 h。取出濾膜，TBS溶液漂洗3遍，每遍5 min，用濾紙吸干膜上液體。等量吸出ECL試劑A和B(每2 cm2膜需ECL總量0.1 ml)，混勻后滴加在膜正面5 min后，將膜上的多余液體吸干，封入保鮮膜，放入壓片盒中。

顯影：在暗室中將膠片放在PVDF膜的正面，蓋上暗盒。曝光2 min后，取出膠片放入顯影液中，待條帶出現(xiàn)后取出用自來水沖洗，放入定影液中。取出膠片，晾干，待拍照用。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用Sigma Stat統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，n代表樣本數(shù)。采用One Way ANOVA法對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和SH-SY5Y細胞活力的影響

分別用終濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L 的 H2O2與細胞共同孵育2 h后檢測細胞活力（見圖1）。結(jié)果顯示：隨著濃度的增加，細胞活力逐漸下降。

神經(jīng)元對照組與0.05 mmol/L組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，與0.1 mmol/L 比較，P＜0.05， 與 0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。SH-SY5Y細胞對照組與0.05 mmol/L比較無統(tǒng)計學(xué)意義，與0.1、0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。

2.2 42.4 mg/L的Gin對H2O2損傷細胞活力的影響

根據(jù)圖1提示：因0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h與對照組比較，P＜0.05，既能制造神經(jīng)元損傷模型，對細胞損傷也不太嚴重，所以采用0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h來檢驗Gin對損傷細胞的保護作用。0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h與0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細胞2 h的細胞活力比較無統(tǒng)計學(xué)意義，所以采用0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細胞2h來檢驗Gin對損傷細胞的保護作用。加入H2O2前，42.4 mg/L的Gin與細胞共孵育12 h。圖2結(jié)果顯示：Gin能明顯抑制H2O2造成的細胞損傷，提高細胞活力。

2.3 42.4 mg/L Gin對H2O2損傷細胞CypA表達的影響

采用圖2的分組方法，H2O2作用后換上加有血清的DMEM培養(yǎng)12 h后提取細胞蛋白，Werstern Blot檢測CypA表達的變化（圖3A）。結(jié)果顯示，42.4 mg/L Gin預(yù)處理12 h，可提高H2O2所致的神經(jīng)元和SH-SY5Y損傷細胞的CypA表達。三次獨立實驗結(jié)果經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描(圖 3B)。

3 討論

銀杏中具有生理活性的主要化學(xué)成分為黃酮苷、萜內(nèi)酯和聚戊烯醇等化合物。其中萜內(nèi)酯類化合物有：銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J及白果內(nèi)酯。已證明銀杏內(nèi)酯均為強的血小板活化因子（PAF）拮抗劑,EGb對PAF的拮抗作用可能與其降低腦損傷大鼠甘氨酸水平、減少PAF誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子水平增加、減弱蛋白激酶C(PKC)激活和降低興奮性氨基酸受體功能等有關(guān)。銀杏內(nèi)酯B可通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性發(fā)揮抗氧化作用。銀杏內(nèi)酯B還能抑制谷氨酸對培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷,其機制可能是通過降低缺血時細胞內(nèi)鈣水平對抗谷氨酸的神經(jīng)毒性[14-15]。H2O2是一種重要的活性氧成分,參與衰老、腦缺血缺氧等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程。它能使膜脂質(zhì)過氧化,膜脂質(zhì)過氧化引起細胞外鈣內(nèi)流激活磷脂酶和蛋白激酶[15]本實驗證實銀杏內(nèi)酯能夠提高雙氧水造成的細胞活力降低。

多數(shù)研究表明，缺血預(yù)處理和低氧預(yù)適應(yīng)能有效減輕神經(jīng)元隨后的嚴重缺血缺氧損傷。這些保護作用與其調(diào)動細胞內(nèi)新的蛋白質(zhì)合成有關(guān)[7,13]，CypA在腦組織廣泛表達，能夠上調(diào)過氧化物還原酶活性，抑制凋亡造成的營養(yǎng)因子缺乏。神經(jīng)元經(jīng)EPO預(yù)處理時，CypA表達上調(diào)。CypA還能與鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度。且能上調(diào)SOD和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，從而發(fā)揮抗氧化功能，降低氧化應(yīng)激引起的細胞損傷[17-23]。銀杏內(nèi)酯對缺血缺氧以及氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷有保護作用[9-12]。

本研究證實銀杏內(nèi)酯能夠提高H2O2所致神經(jīng)元及SHSY5Y損傷細胞的活力，這種保護作用與其上調(diào)CypA的表達有關(guān)。

[1]Handschumacher RE,Harding MW,Rice J,et al.Cyclophilin：a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A[J].Science,1984,226：544-547.

[2]Li M,Wang H,Li F,et al.Effect of cylophilin A on gene expression in human pancreatic cancer cells[J].Am J Surg,2005,190：739-745.

[3]Shen J,Peron MD,Zhu J,et al.Protein expression profiles in pancreatic adenocarcinoma compared with normal pancreatic tissue and tissue affected by pancreatitis as detected by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J].Cancer Res,2004,64(24)：9018-9026.

[4]Rey O,Baluda MA,Park NH.Differential gene expression in neoplastic and human papillomavirus-immortalized oral keratinocytes[J].Oncogene,1999,18(3)：827-831.

[5]Howard BA,Furumai R,Campa MJ,et al.Stable RNA interference-mediated suppression of cyclophilin A diminishes non-small-cell lung tumor growth in vivo[J].Cancer Res,2005,65(19)：8853-8860.

[6]Howard BA,Zheng Z,Campa MJ,et al.Translating biomarkers into clinical practice：prognostic implications of cyclophilin A and macrophage migratory inhibitory factor identified from protein expression profiles in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2004,46(3)：313-323.

[7]Boulos S,Meloni BP,Arthur PG,et al.Evidence that intracellular cyclophilin A and cyclophilin A/CD147 receptor-mediated ERK1/2 signalling can protect neurons against in vitro oxidative and ischemic injury[J].Neurobiol Dis,2007,25(1)：54-64.

[8]GE Yu-song,TENG Wei-yu and ZHANG Chao-dong.Protective effect of cyclophilin A against Alzheimer’s amyloid beta-peptide(25-35)-induced oxidative stress in PC12 cells[J].Chin Med J,2009,122(6)：716-724.

[9]陳宏山,吳小梅,朱俐,等.銀杏內(nèi)酯對培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)細胞缺氧損傷的保護作用[J].南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,21(3)：226-228.

[10]吳小梅,陳宏山,姜正林,等.小鼠皮層神經(jīng)元缺氧損傷的模型制備及其實驗觀察[J].南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1999,19(4)：408-409.

[11]朱俐,吳小梅,李建成,等.銀杏內(nèi)酯對原代培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因表達的影響 [J].Chin J Appl Physiol,2004,20(4)：354-357.

[12]吳小梅,朱俐,金淑儀.銀杏內(nèi)酯對神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護作用與即早基因表達的影響 [J].Chinese Journal of Basic Medicine in Traditional Chinese Medicine,2003,9(7)：51-54.

[13]駱倩倩,楊俊霞,張曉敏,等.銀杏內(nèi)酯B和低氧預(yù)適應(yīng)對小鼠急性缺氧損傷的保護作用[J].Chin J Appl Physiol,2009,25(3)：362-365.

[14]Akisu M,Kultusay N,Coker I,et al.activating factor is an important mediator in hypoxic ischemic brain injury in the new born rat Flunarizine and Ginkgo biloba extract reduce PAF concentration in the brain[J].Biol Neonate,1998,74(6)：439-444.

[15]Logani S,Chen MC,Tran T,et al.Actions of Ginkgo biloba related to potential utility for the treatment of conditions involving cerebral hypoxia[J].Life Sci,2000,67(12)：1389-1396.

[16]丁勤學(xué).銀杏葉對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用及其分子機理[J].國外醫(yī)學(xué)-中醫(yī)中藥分冊,1999,21(1)：6-11..

[17]Lee SP,Hwang YS,Kim YJ,et al.Cyclophilin a binds to peroxiredoxins and activates its peroxidase activity[J].J Biol Chem,2001,276(32)：29826-29832.

[18]Sarafian TA,Verity MA,Vinters HV,et al.Differential expression of peroxiredoxin subtypes in human brain cell types[J].J Neurosci Res,1999,56(2)：206-212.

[19]Jin MH,Lee YH,Kim JM,et al.Characterization of neural cell types expressing peroxiredoxins in mouse brain[J].Neurosci Lett,2005,381(3)：252-257.

[20]Ichimiya S,Davis JG,O'Rourke DM,et al.Murine thioredoxin peroxidase delays neuronal apoptosis and is expressed in areas of the brain most susceptible to hypoxic and ischemic injury[J].DNA Cell Biol,1997,16(3)：311-321.

[21]Meloni BP,Tilbrook PA,Boulos S,et al.Erythropoietin preconditioning in neuronal cultures：signaling,protection from in vitro ischemia and proteomic analysis[J].J Neurosci Res,2006,83(4)：584-593.

[22]Reddy PA,Atreya CD.Identification of simian cyclophilin A as acalreticulin-binding protein in yeast two-hybrid screen and demonstration of cyclophilin A interaction with calreticulin[J].Int J Biol Macromol,1999,25(4)：345-351.

[23]Piotukh K,Gu W,Kofler M,et al.Cyclophilin A binds to linear peptide motifs containing a consensus that is present in many human proteins[J].J Biol Chem,2005,280：23668-23674.