莽山烙鐵頭蛇粗毒的生物學(xué)活性

劉 宇, 聶東宋, 吳 喆, 劉立超, 朱政斌

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006)

蛇毒的研究是天然動(dòng)物毒素研究的一個(gè)重要領(lǐng)域, 也是潛在的發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源[1].國(guó)內(nèi)外的研究表明, 無論在基礎(chǔ)理論還是應(yīng)用研究上, 蛇毒作為新型生物醫(yī)藥的分子模板、神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑、新型生物殺蟲劑的先導(dǎo)分子和蛋白質(zhì)工程的框架分子等方面的研究均有不可替代的作用[2～4].

莽山烙鐵頭蛇是是蝰科腹亞科烙鐵頭蛇屬的一個(gè)新種, 同時(shí)也是我國(guó)瀕臨滅絕的物種. 根據(jù)莽山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)陳遠(yuǎn)輝的調(diào)查[5], 現(xiàn)今只在莽山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn), 并且數(shù)量只有大概 300～500條. 目前只有Murakami對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒素中的PLA2成分進(jìn)行了部分研究[6～8], 而對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒毒液的生物學(xué)功能的研究尚未見報(bào)道.

本研究對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒液的半致死量進(jìn)行了初步研究, 并采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù), 研究了莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元TTX-R鈉離子通道、TTX-S型鈉離子通道、HVA型鈣離子通道和LVA型鈣離子通道的作用.

1 材料與方法

1.1 粗毒與動(dòng)物

莽山烙鐵頭蛇粗毒由湖南省宜章縣境內(nèi)莽山自然保護(hù)區(qū)陳遠(yuǎn)輝提供, 冷凍干燥后使用.Sprague-Dawley(SD)大白鼠由本院動(dòng)物房提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與所需設(shè)備

細(xì)胞外液(mmol/L): TEA-Cl 160, HEPES 10, BaCl22, glucose 10, 用KOH和HCl調(diào)節(jié)pH到7.4; 細(xì)胞內(nèi)液(in mM): CsCl 120, Mg-ATP 5, Na2-GTP 0.4, EGTA 10, HEPES-CsOH 20, 用KOH和HCl調(diào)節(jié)pH到7.2.

臺(tái)式液(mmol/L): NaCl 137, KCl 5. 4, MgCl21, NaH2PO40.33, Hepes 10, Glucose 10, CaCl21. 8, 用氫氧化鈉調(diào)pH值至7.35. 無鈣臺(tái)式液為臺(tái)式液去CaCl2. 記錄鈣電流的電極內(nèi)液CsCl 120, CaCl21, MgCl25,Na2ATP 5, EGTA 11, Hepes 10, Glucose 11用氫氧化銫調(diào)pH值至7.3. 記錄鈣電流的細(xì)胞外液即正常臺(tái)式液.膜片鉗放大器EPC9為HEKA公司產(chǎn)品(Electronid, Lambrecht, German), 拋光儀購(gòu)自日本Nari 公司(Narishige, Japan).

1.3 毒液對(duì)小鼠LD50測(cè)定

取體重18～22g的昆明白小鼠30只, 雌雄不分, 隨機(jī)分成5組, 每組6只. 初毒用生理鹽水溶解, 按每公斤體重8、6.4、5.2、4.0 mg劑量腹腔注射, 對(duì)照組注射等體積的生理鹽水, 觀察24h. LD50的計(jì)算按照改進(jìn)寇氏法公式:其中Xm為最大劑量的對(duì)數(shù); p為各組動(dòng)物的死亡率, 以小數(shù)表示(如 80%寫作 0.8);為各組動(dòng)物死亡率的總和( p1+p2+p3+p4+p5); I為相鄰兩組劑量( D )對(duì)數(shù)值之差.

1.4 細(xì)胞急性分離

大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元細(xì)胞的急性分離與培養(yǎng)基本按Wang等[9]報(bào)道的方法進(jìn)行, 簡(jiǎn)述如下:將 4～8周齡Sprague-Dawley大鼠(雌雄不拘)擊昏后斷頭, 迅速取出胸腰段脊柱, 放入氧氣飽和的DMEM培養(yǎng)液中. 由剖開的椎管內(nèi)側(cè)取出神經(jīng)節(jié), 并在體視顯微鏡下用剪除DRG相連的神經(jīng)和周圍的結(jié)締組織被膜, 然后將分離得到的DRG盡量剪碎, 置于消化試管中. 消化液配方為: 1.5mg胰蛋白酶, 3.5mg膠原酶,0.3mg DNA酶, 溶于5ml 氧氣飽和的DMEM培養(yǎng)液中, 34℃消化30 min, 其中每間隔 10 min 左右吹散組織塊一次, 消化完畢后用 7.6mg胰蛋白酶抑制劑中止酶反應(yīng). 將消化得到的細(xì)胞液經(jīng) 800 rpm低速離心5min, 使細(xì)胞沉于離心管底, 小心吸去大部分消化液; 加入5ml 原代細(xì)胞培養(yǎng)液(95% DMEM培養(yǎng)液, 5%新生牛血清, 次黃嘌呤-氨喋呤胸-腺苷補(bǔ)充液洗一次, 吹散沉于底部的細(xì)胞, 再經(jīng)800 rpm低速離心5min,去培養(yǎng)液. 加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液, 將沉于底部的細(xì)胞吹散均勻后, 以每皿1～1.2ml細(xì)胞液的量分裝到35mm培養(yǎng)皿中, 共分成4或5 皿, 置于CO2培養(yǎng)箱中, 在5% CO2和 95%空氣的濕潤(rùn)環(huán)境中37℃培養(yǎng), 經(jīng)2 hr培養(yǎng), 細(xì)胞貼壁后即可進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn).

1.5 全細(xì)胞記錄

電流記錄通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用放大器 EPC9在電腦上進(jìn)行. 計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件. 玻璃電極管為 100μL硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管. 玻璃電極兩步拉制而成, 經(jīng)拋光儀(Nari- shige, Japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm, 充灌電極液后電極電阻為1～3 M?. 膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溫度的變動(dòng)最多上下不超過2℃.

使用Ba2+作為Ca2+的電荷替代物, 鈣通道電流(ICa)的大小通過測(cè)得IBa值來確定. 實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞外液(in mM): 160 TEA-Cl, 10 HEPES, 2 BaCl2, 10 glucose和200 nM TTX, 用TEA-OH調(diào)節(jié) pH到7.4; 細(xì)胞內(nèi)液(in mM): 120 CsCl, 5 Mg-ATP, 0.4 Na2-GTP, 10 EGTA, 20 HEPES-CsOH, 調(diào)節(jié)pH到7.2. 當(dāng)DRG細(xì)胞形成全細(xì)胞記錄模式后, 將膜電位鉗制在?90mV或?40mV, 然后去極化到?40mV或+60mv, 記錄到IBa. 測(cè)定鈉電流的細(xì)胞外液(in mM): 50 NaCl, 90 choline chloride, 20 TEA-Cl, 5 D-glucose, 5 HEPES, 1 MgCl2, 1 CaCl2,調(diào)pH到 7.4, 再在其中加入 10μM NiCl2, 用來阻斷Ca2+電流. 細(xì)胞內(nèi)液: 125 CsCl, 20 NaF, 5 HEPES, 5 EGTA, 用1M CsOH調(diào)pH到7.2. 采用SigmaPlot 8.0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 毒液對(duì)小鼠LD50測(cè)定

利用 Bradfordf 法測(cè)得粗毒的蛋白質(zhì)含量為 38.60 %, 而莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)小鼠的半致死量 LD50值為4.3 mg/kg, 提示粗毒對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的毒性. 此外, 經(jīng)腹腔注射后, 小鼠隨即出現(xiàn)畏冷、全身震顫的現(xiàn)象; 不進(jìn)食, 呼吸急促, 眼睛睜不開, 四肢癱軟, 出現(xiàn)爬行困難, 產(chǎn)生麻痹作用, 皮毛因大量出汗而聚結(jié),失去光澤, 嚴(yán)重者出現(xiàn)全身抽搐、尿失禁等癥狀. 高劑量組小鼠全部死亡. 這提示粗毒中有神經(jīng)毒素成分, 解剖死亡小鼠尸體, 發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟有大量淤血,提示粗毒中可能含有纖溶酶等溶血毒素成分.

2.2 莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)DRG 細(xì)胞膜上鈉電流的影響

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞膜上 2 種鈉通道(TTX-S 型和TTX-R 型)所占比例與細(xì)胞大小有關(guān).一般認(rèn)為直徑為 20～40 μm的細(xì)胞幾乎只含有TTX-S鈉通道, 而 TTX-R 鈉通道主要分布于直徑小于20μ m的細(xì)胞上[10]. 為觀察毒素對(duì) 2 種鈉通道的影響, 我們分別選用相應(yīng)大小的DRG 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 在全細(xì)胞記錄模式下, 將膜電壓維持在?80mV, 以+10 mV 步幅、50 ms 時(shí)程去極化至+50mV, 分別誘導(dǎo)出加毒素前后的TTX-S (圖 1)和TTX-R 鈉電流(圖 2). 再根據(jù)去極化的電壓和相應(yīng)誘導(dǎo)電流的大小作出TTX-S 和TTX-R 鈉電流的I-V曲線圖. 圖1表明, 加粗毒100 mg/L 4min 后電流幅度沒有變化, 其激活閾值和峰值電壓沒有改變, 逆轉(zhuǎn)電壓也沒有發(fā)生明顯漂移, 說明粗毒不影響TTX-S 鈉通道的離子選擇透過性. 圖2 表明, 加10 mg/L 粗毒后電流立即開始減小, 加 100 mg/L和1000 mg/L粗毒后電流的抑制現(xiàn)象有所加強(qiáng), 表明粗毒對(duì)TTX-R鈉電流的抑制效應(yīng)具有濃度依從性,上述結(jié)果表明莽山烙鐵頭蛇毒素是一種TTX-R型鈉通道阻斷劑, 而對(duì)TTX-S型鈉通道無明顯影響.

圖1 毒粗毒對(duì)TTX-S型鈉通道的阻斷作用分析

圖2 粗毒對(duì)TTX-R型鈉通道的阻斷作用分析

圖3 粗毒對(duì)HVA型鈣通道的阻斷作用分析

2.3 莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)DRG細(xì)胞膜上鈣電流的影響

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)觀察了莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)HVA和LVA型鈣通道離子電流變化,大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞在 100mg/L和1000mg/ L作用10 min 后的Ica的I-V 曲線表明:粗毒對(duì)HVA型(圖3)和LVA(圖4)鈣通道具有明顯抑制作用, 100 mg/L和1000 mg/ L的粗毒濃度依賴性地減少 ICa. 提示粗毒中含有 HVA和LVA型鈣通道離子的抑制成分.

電壓門控性鈉通道是調(diào)節(jié)此類神經(jīng)元興奮性和動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳播的重要離子通道[10].莽山烙鐵頭蛇毒素能濃度依賴地抑制DRG細(xì)胞膜上TTX-R鈉通道電流峰值, 中、高濃度的莽山烙鐵頭蛇毒素溶液還電壓依賴地影響通道的激活過程, 使通道電流的半激活電壓向去極化方向偏移, 導(dǎo)致TTX-R鈉通道必須達(dá)到更大的去極化程度方可最大激活TTX-R鈉電流, 延緩了其激活過程. 由此我們推斷, 莽山烙鐵頭蛇毒素對(duì)TTX-R鈉通道的調(diào)節(jié)可能直接干預(yù)痛覺信息中樞傳入的過程.

圖4 粗毒對(duì)LVA型鈣通道的阻斷作用分析

3 結(jié)束語

本文對(duì)莽山烙鐵頭蛇粗毒的生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究, 確定了其對(duì)小鼠的半致死量, 同時(shí)采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù), 研究了莽山烙鐵頭蛇粗毒對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元河豚毒素不敏感(TTX-R)鈉通道、河豚毒素敏感(TTX-S)鈉通道、低電壓激活(LVA)電壓依賴性鈣離子通道和高電壓激活(HVA)鈣離子通道的影響. 下一步我們將通過分離粗毒中的各種有效成分, 并進(jìn)一步確定其生物學(xué)功能.

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