2010年夏季急性細(xì)菌感染性腹瀉患兒沙門菌感染分析

王愛敏, 何磊燕, 許學(xué)斌, 宋建明, 薛建昌, 王傳清

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 210102； 2. 上海市疾病預(yù)防與控制中心，上海 200336

沙門菌(Salmonella)是一種重要的通過食物傳播的病原菌，可引起人類傷寒、副傷寒、食物中毒、胃腸炎、敗血癥和局部感染等多種疾病。在某些情況下，尤其是在兒童、老年人和免疫缺陷患者中，非傷寒沙門菌(non-typhoidalSalmonella，NTS)導(dǎo)致的侵入性和病灶性感染十分嚴(yán)重[1]。沙門菌病是世界 各地的常見病和多發(fā)病，歐美地區(qū)發(fā)病率為10/10萬～83/10萬[2]。目前已知的沙門菌血清型有2 587種[1]，且抗原變異多。不同血清型沙門菌對抗菌藥物的敏感度存在差異。為了解本院沙門菌感染的現(xiàn)狀及耐藥特點(diǎn)，我們對2010年夏季急性細(xì)菌感染性腹瀉患兒進(jìn)行腸道沙門菌感染監(jiān)測，并對該菌的耐藥性進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2010年7月1日～9月30日復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院門診及住院急性細(xì)菌感染性腹瀉患兒糞便標(biāo)本，進(jìn)行沙門菌分離、培養(yǎng)和鑒定。兒童急性細(xì)菌感染性腹瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：大便形狀改變，呈稀便、水樣便、黏液便或膿血便，大便次數(shù)比平時(shí)增多，病程在2周內(nèi)。糞便常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞增多或有吞噬細(xì)胞[3]?；純壕鶠榘l(fā)病當(dāng)日或次日就診, 就診前未使用過抗生素。

1.2 方法

1.2.1 分離、培養(yǎng)及生化鑒定[2]采用沙門菌直接篩選、分離、培養(yǎng)結(jié)合增菌的培養(yǎng)法。材料包括木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉(xylose-lysine-desoxycholate，XLD)瓊脂平板、亞硒酸鹽煌綠(selenite brilliant green, SBG)增菌液肉湯、沙門菌顯色平板(CHROMAgar Salmonella，CAS)顯色培養(yǎng)基、腸道綜合發(fā)酵管等，由上海美翔生物技術(shù)有限公司提供。將新鮮糞便拭子接種于XLD瓊脂平板，然后將糞便拭子放入SBG液體培養(yǎng)基中充分?jǐn)噭?dòng)后取出；將XLD分離平板和SBG增菌管置37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，挑取XLD平板中心黑色邊緣較透明或淺紅色的可疑菌落接種于CAS平板和雙糖管中，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行初步沙門菌鑒定；同時(shí)將培養(yǎng)過夜的SBG增菌液轉(zhuǎn)種到XLD平板，采取同樣的培養(yǎng)條件及初步鑒定法對沙門菌進(jìn)行再次篩查、培養(yǎng)及鑒定。沙門菌在CAS平板呈酒紅色，糖初篩試驗(yàn)符合K/A、H2S+/-、動(dòng)力+、吲哚-、蔗糖-。采用血清學(xué)凝集試驗(yàn)進(jìn)行確診及血清型分型。

1.2.2 血清學(xué)分型試驗(yàn) 用針對沙門菌群(A～F)抗原、菌體(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清對沙門菌進(jìn)行血清型鑒定。方法為挑取雙糖斜面上少量菌苔與A～F多價(jià)抗血清在室溫下進(jìn)行玻片凝集，1 min內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價(jià)抗血清進(jìn)行逐一凝集來確定O抗原，根據(jù)確定的O抗原進(jìn)行相應(yīng)的H多價(jià)和單價(jià)血清凝集以確定最終血清型。玻片凝集時(shí)需設(shè)生理鹽水對照和標(biāo)準(zhǔn)菌株對照。標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC 14028。沙門菌診斷血清為蘭州生物制品研究所和寧波天潤生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法。藥敏試驗(yàn)用MH瓊脂平板為上海祥和生物有限公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌為ATCC 25922。根據(jù)2010年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)對沙門菌的監(jiān)測要求，選擇12種抗菌藥物：氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氯霉素、磺胺甲基異唑-甲氧芐啶、阿莫西林-克拉維酸、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢美唑和磷霉素?？咕幬锛埰瑸橛鳲xoid公司或美國BBL公司產(chǎn)品。按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2009年M100-S19標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用WHONET5.3分析細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性，組間差異采用SPSS16.0 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡組患兒沙門菌分離率

患兒年齡0～16歲。于2010年7月1日～9月30日收集門診及住院急性細(xì)菌感染性腹瀉患兒糞便標(biāo)本1 045例，共分離出沙門菌160株，總分離率為15.3%。其中收集<1歲患兒糞便標(biāo)本505例，分離出沙門菌119株，分離率為23.6%；收集1～5歲患兒糞便標(biāo)本423例，分離出沙門菌32株，分離率為7.6%；收集>5歲患兒糞便標(biāo)本117例，分離出沙門菌9株，分離率為7.7%。

2.2 沙門菌血清分型

對分離出的160株沙門菌進(jìn)行血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn)，共鑒定出21種沙門菌血清型，另有4株暫未鑒定到種。其中鼠傷寒沙門菌65株，占40.6%；腸炎沙門菌40株，占25.0%。兩者共占65.6%，為主要的沙門菌株。少見的沙門菌有阿爾巴尼沙門菌、伊魯慕沙門菌、巴雷利沙門菌、羅森沙門菌、姆班達(dá)卡沙門菌、奧道奈茲沙門菌等。有4例沙門菌未鑒定到種。菌種分布見表1。鼠傷寒沙門菌中，<1歲患兒46例，占70.8%；1～5歲患兒15例，占23.1%；>5歲患兒4例，占6.2%。<1歲患兒感染鼠傷寒沙門菌的比率與1～5歲患兒和>5歲患兒相比，有顯著性差異(χ2=121，P<0.001)。腸炎沙門菌中，<1歲患兒19例，占47.5%；1～5歲患兒16例，占40%；>5歲患兒5例，占12.5%。年齡分布亦有明顯差異(χ2=78，P<0.001)。

表1 臨床分離沙門菌的菌種分布

Tab.1 Distribution of clinical isolates ofSalmonellaspp.

Microorganism Number of strainsPercent (%)Salmonella typhimurium6540.6Salmonella enteritidis4025Salmonella agona85Salmonella saintpaul53.1Salmonella meleagridis53.1Salmonella senftenberg42.5Salmonella paratyphi B42.5Salmonella infantis42.5Salmonella irumu31.9Salmonella aberdeen31.9Salmonella thompson21.3Salmonella stanley21.3Salmonella derby21.3Salmonella braenderup21.3Salmonella anatum10.6Salmonella potsdam10.6Salmonella albany10.6Salmonella bareilly10.6Salmonella rissen10.6Salmonella mbandaka10.6Salmonella ordonez10.6Salmonella spp.42.5Total160100

2.3 2種常見沙門菌對抗菌藥物的耐藥性

鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌對氨芐西林的耐藥率分別高達(dá)91.4%和69.0%；對第3代頭孢菌素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌接近30%，而腸炎沙門菌不超過7%；鼠傷寒沙門菌對磺胺甲基異唑-甲氧芐啶耐藥率亦高達(dá)82.8%，對含酶抑制劑青霉素類、氯霉素及磺胺甲基異唑-甲氧芐啶的耐藥率均高于腸炎沙門菌；2種沙門菌對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭霉素類、磷霉素及頭孢哌酮-舒巴坦的耐藥率均較低(表2)。結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌對以上12種抗生素耐藥率在3個(gè)年齡組中的分布均有顯著性差異(P<0.001)，腸炎沙門菌對以上12種抗生素耐藥率在3個(gè)年齡組中的分布也有顯著性差異(P<0.001)。在鼠傷寒沙門菌中，發(fā)現(xiàn)3例廣泛耐藥菌株，其對氨芐西林、第3代頭孢菌素、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭霉素類藥物均耐藥。未發(fā)現(xiàn)廣泛耐藥的腸炎沙門菌。

3 討論

腹瀉是兒童常見疾病，尤其在發(fā)展中國家。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估計(jì)，發(fā)達(dá)國家每年約30%的人患食源性疾病[5]；發(fā)展中國家更嚴(yán)重，估計(jì)每年腹瀉及相關(guān)疾病有217億病例，導(dǎo)致240萬5歲以下兒童死亡。美國于1996～1999年調(diào)查的7種(空腸彎曲菌、大腸埃希菌O157：H7、沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬)細(xì)菌性食物中毒中，沙門菌位居第2位(33%)。1989～1990年日本檢出結(jié)果顯示，沙門菌占腸道病原菌的首位。我國多年來沙門菌食物中毒一直居細(xì)菌性食物中毒的首位(64%)[2]。我院調(diào)查也顯示，2010年夏季急性細(xì)菌性腹瀉患兒中沙門菌感染率超過15%。

沙門菌感染全年均可發(fā)病，夏季是感染高峰，嬰幼兒是易感人群。有報(bào)道顯示，在沙門菌感染病例中，<1歲患兒占81.4%[6]。本次資料顯示，在所有沙門菌感染病例中，<1歲患兒占74.4%(119/160)，符合沙門菌感染的患者年齡特征。

表2 沙門菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率

Tab.2 Sensitivity and resistance rates ofSalmonellaspp. to antimicrobial agents

AntibioticSalmonella typhimuriumS(%)R(%)Salmonella enteritidisS(%)R(%)Salmonella spp.S(%)R(%)Ampicillin8.691.431.069.067.532.5Ampicillin-sulbactam17.550.975.9075.012.5Cefotaxime62.129.389.76.982.512.5Ceftriaxone65.529.393.16.985.015.0Ciprofloxacin48.36.996.6090.010.0Azithromycin83.38.386.710.389.310.7Chloramphenicol31.06993.13.477.520.0Sulfamethoxazole-trimethoprim17.282.889.710.356.441.0Amoxycillin-clavulanic acid34.536.279.3072.520.0Cefoperazone-sulbactam79.3089.701000Cefmetazole93.16.9100095.55.0Fosfomycin100010001000

S, sensitivity rate; R, resistance rate.

自1993年以來，非傷寒沙門菌感染以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主[7]。此次調(diào)查共分離到21種血清型，其中鼠傷寒沙門菌占40.6%、腸炎沙門菌占25.0%，兩者占總分離率的65.6%。深圳于2009年分離到的沙門菌中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌占58.8%[8]。2008年北京夏季沙門菌感染中，亦以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主，共占71.06%[9]。提示我國目前流行的沙門菌血清型為鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。<1歲患兒感染鼠傷寒沙門菌的比率明顯高于1～5歲和>5歲患兒。此次分離到6種少見的血清型，有4種沙門菌未鑒定到種。

沙門菌是人畜共患病的致病菌。長期以來，為治療、預(yù)防疾病和促進(jìn)畜禽生長，抗生素廣泛添加到動(dòng)物飼料中，致使沙門菌耐藥性不斷上升。耐藥的沙門菌通過畜禽再傳播給人類，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。特別是鼠傷寒沙門菌對氯霉素、氨芐西林等普通抗生素及磺胺類藥物普遍耐藥，對氟喹諾酮類藥物耐藥的病例亦日益增多，對第3代頭孢菌素亦出現(xiàn)耐藥。在歐洲，40%的沙門菌分離株至少對1 種抗生素耐藥，18%的分離株為多重耐藥(muitidrug resistance，MDR)表型[10]。在非洲，沙門菌對氯霉素、磺胺甲基異唑-甲氧芐啶、氨芐西林的耐藥率為36%～59%[11]。國內(nèi)一項(xiàng)調(diào)查顯示，2003～2008年鼠傷寒沙門菌對氨芐西林的耐藥率從4.4%增至51.4%，對頭孢噻肟的敏感率從100%降至82.8%，對磺胺甲唑/甲氧芐啶的敏感率從100%降至52.8%[12]。一項(xiàng)上海市鼠傷寒沙門菌流行研究顯示，鼠傷寒沙門菌臨床病例腹瀉株在2005～2007年對磺胺類藥物的耐藥率從17.4% 上升至35.5%，多重耐藥株從2005年的1株上升至2007年的6株，對第3代氟喹諾酮類藥物也有5.7%～9.7%的低水平耐藥，對第3代頭孢菌素未見耐藥[13]。而在本次研究中，鼠傷寒沙門菌的耐藥率普遍高于其他沙門菌。其對氨芐西林的耐藥率已高達(dá)91.4%；對磺胺甲基異唑-甲氧芐啶耐藥率亦高達(dá)82.8%；對第3代頭孢菌素如頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥率也接近30%；對環(huán)丙沙星呈低度耐藥，耐藥率為6.9%。沙門菌對頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢美唑、磷霉素仍高度敏感。

目前多重耐藥菌十分猖獗，多重耐藥的發(fā)生率近年來顯著增長，原因之一就是具有多重耐藥性的鼠傷寒沙門菌DT104在全球范圍內(nèi)傳播。沙門菌的耐藥性主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，其多重耐藥性的獲得主要與質(zhì)?；蚝腿旧w基因突變有關(guān)。多重耐藥的水平轉(zhuǎn)移通常是由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子內(nèi)的基因盒介導(dǎo)。高耐藥和多重耐藥鼠傷寒沙門菌(如DT104) 的出現(xiàn)是多種耐藥機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性使耐藥菌株迅速擴(kuò)散、蔓延，導(dǎo)致防治困難，因此細(xì)菌的高耐藥率亟待解決[14]。耐藥細(xì)菌通常通過食物鏈傳播給人[15]，因此動(dòng)物源性沙門菌新的耐藥機(jī)制的出現(xiàn)，將直接決定人源性沙門菌的耐藥性。我們必須積極開展沙門菌耐藥機(jī)制研究和流行病學(xué)調(diào)查，遏制不合理的抗生素應(yīng)用，持續(xù)監(jiān)測沙門菌的耐藥性變化。臨床醫(yī)師在選擇藥物時(shí)，應(yīng)主要參考本地區(qū)某一時(shí)段的耐藥性監(jiān)測結(jié)果，制訂治療方案，避免盲目使用及濫用抗生素。

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