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    HPLC法測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)研究

    2011-01-24 02:42:40姚卓賢夏宗玲于鋒
    中國藥房 2011年17期
    關(guān)鍵詞:洛伐他汀微粒體精密度

    姚卓賢,夏宗玲,于鋒

    (1.中國藥科大學(xué),南京市 210009;2.江蘇常州市第一人民醫(yī)院藥劑科,常州市 213001)

    HPLC法測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)研究

    姚卓賢1,2*,夏宗玲2,于鋒1#

    (1.中國藥科大學(xué),南京市 210009;2.江蘇常州市第一人民醫(yī)院藥劑科,常州市 213001)

    目的:考察測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)。方法:采用高效液相色譜法,內(nèi)標(biāo)為地西泮,色譜柱為UltimateXB-C18,流動相為乙腈-水(70∶30),流速為1.0mL·min-1,檢測波長為238nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果:大鼠肝微粒體中洛伐他汀檢測濃度的線性范圍為2.5~40μmol·L-1(r=0.9983),低、中、高濃度洛伐他汀溶液的日內(nèi)RSD分別為5.44%、2.89%、2.83%,日間RSD分別為5.48%、1.84%、1.91%,方法回收率分別為(109.24±3.28)%、(104.82±5.92)%、(102.17±1.92)%,絕對回收率分別為(104.65±2.93)%、(113.72±6.25)%、(101.92±1.89)%。結(jié)論:方法學(xué)考察結(jié)果表明,本方法簡單易行、靈敏度高,可用于肝微粒體中洛伐他汀的含量測定。

    高效液相色譜法;洛伐他??;大鼠;肝微粒體;含量測定

    他汀類藥物為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,是目前臨床上廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)血脂的藥物,占據(jù)了全球調(diào)節(jié)血脂類藥物60%的市場份額[1]。其能使血漿膽固醇濃度降低,并已有文獻(xiàn)[2]證明該類藥物可降低高血脂患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險和冠心病患者的死亡率。在動脈粥樣硬化形成的眾多因素中,高血脂與動脈粥樣硬化密切相關(guān),也是冠心病的獨(dú)立因素[3]。洛伐他?。↙ovastatin)是他汀類降脂藥,該藥物口服吸收后主要分布于肝臟中[4],經(jīng)肝細(xì)胞色素P450(CYP)同工酶CYP3A4通道代謝成無活性的產(chǎn)物排出體外。近年來,隨著醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展進(jìn)步,多藥聯(lián)用越來越普遍,發(fā)生藥物相互作用及不良反應(yīng)的可能性也隨之增加,為此,筆者建立了在大鼠離體肝微粒體中測定洛伐他汀含量的方法并進(jìn)行了方法學(xué)考察。雖然沒有對大鼠肝微粒體中洛伐他汀的含量進(jìn)行測定,但本方法可為其含量測定打下基礎(chǔ)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng),包括2996紫外檢測器、1525雙元梯度泵、717自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站(美國Waters公司);電子分析天平(塞多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,精密度:1×10-5g);5417R高速臺式離心機(jī)(德國Effendorf公司);低溫冰箱(日本Sanyo公司);旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);恒溫振蕩水槽(上海精宏儀器設(shè)備有限公司);雪花制冰機(jī)(北京長流科學(xué)儀器公司)。

    1.2 試藥

    洛伐他汀原料藥(浙江省江北藥業(yè)有限公司,批號:090301,純度:96%);地西泮對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:230-9601,純度:99%);乙腈(上海試一化學(xué)試劑有限公司,HPLC級,純度:>99.7%);水為超純水;枸櫞酸三鈉鹽、枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ均購于Sigma-Aldrich(上海)試劑公司。

    1.3 動物

    SD大鼠,♂,體重200~250g,月齡1.5個月,購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,合格證號:SCXK(滬)2003-0003。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-水(70∶30);檢測波長:238nm;流速:1.0mL·min-1;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 洛伐他汀貯備液。精密稱取洛伐他汀原料藥40.45mg,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。2.2.2地西泮溶液。精密稱取地西泮對照品5.4mg,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,混勻得216μg·mL-1的地西泮溶液,待用。

    2.2.3 再生系統(tǒng)的制備。枸櫞酸三鈉鹽2.8mg、枸櫞酸脫氫酶0.5mg(相當(dāng)于10u)、0.15mol·L-1氯化鎂0.1mL、0.1mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(pH7.4)0.9mL,混合,可根據(jù)需要按比例制備一定量,臨用新配。

    2.3 微粒體樣品處理[5]

    取大鼠離體肝微粒體適量,用新鮮制備的再生系統(tǒng)稀釋成蛋白濃度為1.0mg·mL-1的混懸液,取此混懸液0.2mL,加洛伐他汀貯備液2μL,混勻,加啟動劑(氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%碳酸氫鈉溶液,終濃度為0.25mmol·L-1/0.1mmol·L-1),放入溫度為37℃的水箱中,孵育20min后取出,加入冰冷的乙腈0.2mL(含10μL地西泮,終濃度為5.4μg·mL-1)沉淀蛋白,渦旋1min,15000r·min-1離心10min,即得樣品溶液。取上清液20μL進(jìn)樣測定。

    2.4 色譜行為

    取大鼠離體微粒體適量,用新鮮制備的再生系統(tǒng)稀釋成蛋白濃度為1.0mg·mL-1的混懸液,將此混懸液沉淀蛋白后取上清液作為空白肝微粒體;然后在空白肝微粒體混懸液中加入洛伐他汀貯備液2μL、地西泮溶液10μL,再將此混懸液沉淀蛋白后取上清液;將上述2種上清液及樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜。結(jié)果,洛伐他汀與內(nèi)標(biāo)物地西泮的保留時間分別為12.42、6.07min,色譜峰分離良好,且空白肝微粒體中未見雜質(zhì)峰干擾,色譜詳見圖1。

    圖1 高效液相色譜圖A.空白肝微粒體;B.空白肝微粒體+洛伐他汀+地西泮;C.樣品溶液;1.洛伐他汀;2.地西泮Fig1 HPLC chromatogramsA.blank liver microsome;B.blank liver microsome+lovastatin+diazepam;C.sample solution;1.lovastatin;2.diazepam

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    取一定量洛伐他汀貯備液,加甲醇稀釋成含洛伐他汀40、20、10、5、2.5μmol·L-1的系列溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,取20μL進(jìn)樣,記錄色譜。以溶液中待測物洛伐他汀濃度(X)為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,得回歸方程為Y=0.0355X+0.0102(r=0.9983)。結(jié)果表明,大鼠肝微粒體中洛伐他汀濃度與峰面積比值在檢測濃度2.5~40μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

    2.6 精密度試驗(yàn)

    取一定量洛伐他汀貯備液,加甲醇稀釋成含洛伐他汀3.75、10、30μmol·L-1的溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,取20μL進(jìn)樣,同日內(nèi)重復(fù)測定5次,連續(xù)測定3d,計算洛伐他汀的日內(nèi)RSD和日間RSD。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

    表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=5)Tab1 Results of precision tes(t±s,n=5)

    表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=5)Tab1 Results of precision tes(t±s,n=5)

    濃度/μmol·L-1 3.751030日內(nèi)精密度測得值/μmol·L-1 4.08±0.00410.38±0.00530.63±0.021RSD/%5.442.892.83日間精密度測得值/μmol·L-1 4.13±0.00810.65±0.00631.25±0.048RSD/%5.481.841.91

    2.7 回收率試驗(yàn)

    取一定量洛伐他汀貯備液,加甲醇稀釋成含洛伐他汀3.75、10、30μmol·L-1的溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,取20μL進(jìn)樣,每個濃度進(jìn)行5個樣本分析,計算方法回收率(即將所得信號比值代入回歸方程,求得測定值,與加入量比較)及絕對回收率(即測得洛伐他汀和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值與相同濃度的洛伐他汀和內(nèi)標(biāo)物的純?nèi)芤旱姆迕娣e比值比較),結(jié)果見表2。

    表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=5)Tab2 Results of recovery test(±s,n=5)

    表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=5)Tab2 Results of recovery test(±s,n=5)

    RSD/%2.995.641.87加入量/μmol·L-1 3.751030測得值/μmol·L-1 4.09±0.1210.48±0.5930.74±0.58絕對回收率x/%104.65±2.93113.72±6.25101.92±1.89RSD/%2.805.491.86方法回收率x/%109.24±3.28104.82±5.92102.17±1.92

    2.8 穩(wěn)定性考察

    制備濃度為3.75、10、30μmol·L-1的洛伐他汀溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,將樣品放置在室溫及4℃冰箱內(nèi),于0、1、5、24、30、48、72h分別進(jìn)樣分析。結(jié)果,RSD均<5.41%,表明樣品溶液在室溫及4℃下放置72h內(nèi)穩(wěn)定。

    3 討論

    有文獻(xiàn)[6]報道,以乙腈-磷酸為流動相采用線性梯度洗脫法測定洛伐他汀的含量,但此法操作比較煩瑣,不利于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測定。筆者分別嘗試使用甲醇-水=50∶50、70∶30,以及乙腈-水=50∶50、70∶30作為流動相進(jìn)行測定,結(jié)果表明,當(dāng)乙腈-水=70∶30為流動相時,色譜分析在14min內(nèi)完成,洛伐他汀、內(nèi)標(biāo)物和雜質(zhì)分離完全,可用于大鼠肝微粒體中洛伐他汀的含量測定。

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,本文所建立的肝微粒體中洛伐他汀含量的測定方法,簡單易行,靈敏度高,具有可操作性,便于在臨床上推廣應(yīng)用。

    [1]蔡德山.“他汀類”調(diào)血脂藥物市場分析[J].中國醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理,2008,2(7):9.

    [2] 龐國強(qiáng).他汀類藥物的藥理與臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,7(1):11.

    [3] 王忠全,丁卓玲.4種他汀類藥物治療高血脂癥成本-效果分析[J].中國藥房,2007,18(26):2008.

    [4] 鄧萬俊.他汀類藥物與其他藥物的相互作用[J].中國新藥與臨床雜志,2006,25(2):131

    [5] 夏宗玲,許建平,鄒素蘭.探針?biāo)幬锓y定CYP4503A的活性[J].藥學(xué)與臨床研究,2010,18(2):142.

    [6] 張西如,高燕霞,姜建國.RP-HPLC測定洛伐他汀及片劑的有關(guān)物質(zhì)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2009,26(13):1148.

    Methodological Study of Content Determination of Lovastatin in Rat Liver Microsomes by HPLC

    YAO Zhuo-xian,YU Feng
    (China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)
    YAO Zhuo-xian,XIA Zong-ling
    (Dept.of Pharmacy,Changzhou First People’s Hospital in Jiangsu Province,Changzhou 213001,China)

    OBJECTIVE:To investigate the methology of the content determination of lovastatin in rats liver microsomes.METHODS:HPLC method was adopted with diazepam as internal standard.The determination was performed on UltimateXB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water(70∶30)at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 238nm and column temperature was 30℃.The injection volume was 20μL.RESULTS:The calibration curves of lovastatin were linear in the range of 2.5~40μmol·L-1(r=0.9983).The intra-day RSD of lovastatin at low,medium and high concentrations were 5.44%,2.89%and 2.83%,and the inter-day RSD were 5.48%,1.84%and 1.91%,respectively.The relative recoveries were(109.24±3.28)%,(104.82±5.92)%,(102.17±1.92)%,and the absolute recoveries were(104.65±2.93)%,(113.72±6.25)%,(101.92±1.89)%,respectively.CONCLUSION:Results of methological study show that the method is simple,sensitive and suitable for the content determination of lovastatin in rat liver microsomes.

    HPLC;Lovastatin;Rat;Liver microsomes;Content determination

    R972+.6;R969

    A

    1001-0408(2011)17-1562-02

    *藥師。研究方向:醫(yī)院藥學(xué)。電話:0519-68870866。E-mail:sylvia2819@hotmail.com

    #通訊作者:教授,博士。研究方向:臨床藥學(xué)和藥理學(xué)。電話:025-83271299。E-mail:yufengcpu@163.com

    2010-07-12

    2010-10-10)

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